MiR-155參與糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙及其機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病(Diabetes melintus,DM)已成為威脅人類健康的一大類疾病，其發(fā)病率逐年增加，發(fā)病年齡日趨年輕化。DM患者晚期常死于各類并發(fā)癥，其中大血管和微血管病變是致死、致殘的主要原因。已有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞功能的異常變化在糖尿病血管病變過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　 血管內(nèi)皮通過釋放舒張和收縮因子調(diào)節(jié)血管的基礎(chǔ)張力以及生理、病理狀態(tài)下血管對(duì)機(jī)械張力和神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)性，在血管功能的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮

2、了重要作用。其中，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)生成的NO是調(diào)控血管舒張反應(yīng)的最重要因素。而且，越來(lái)越多的證據(jù)表明，NO不僅參與血管張力的調(diào)節(jié)，還具有抑制血小板聚集，降低內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，抑制單核細(xì)胞和白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等功能，說明eNOS/NO通路在維持心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用。
　　 大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮

3、依賴性舒張反應(yīng)降低是糖尿病發(fā)病早期的標(biāo)志性變化。盡管糖尿病內(nèi)皮功能損害是多因素綜合作用的結(jié)果，但eNOS/NO通路的異常是導(dǎo)致內(nèi)皮損害最主要的原因。在血管內(nèi)皮細(xì)胞，NO的合成依賴于eNOS的活性和表達(dá)水平。因此，深入探討糖尿病發(fā)病過程中eNOS的活性和表達(dá)異常變化的機(jī)制，對(duì)尋找防治糖尿病血管合并癥的新靶點(diǎn)具有重要意義。
　　 MicroRNA是最近發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性保守非編碼RNA小分子，大小約22個(gè)核苷酸左右，它通過與目標(biāo)mRN

4、A3'端非翻譯區(qū)配對(duì)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因的表達(dá)。近期大量研究報(bào)導(dǎo)了MicroRNA廣泛參與了糖尿病相關(guān)過程的調(diào)控，包括胰島素分泌、胰腺發(fā)育、β細(xì)胞分化，糖代謝、脂代謝等。在血管內(nèi)皮細(xì)胞，已往研究表明MicroRNA參與調(diào)控了細(xì)胞的多種功能，如血管生成和炎癥反應(yīng)等。但microRNA是否參與調(diào)控糖尿病內(nèi)皮功能障礙和血管合并癥的發(fā)生，尚不清楚。miR-155位于非編碼基因Bic內(nèi)，在血液細(xì)胞中高表達(dá)。已有研

5、究表明miR-155參與調(diào)控T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的分化，從而影響機(jī)體的免疫功能。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在內(nèi)皮細(xì)胞有表達(dá)，可溶性CD40分子和TNFα可上調(diào)其表達(dá)，但其在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能尚未見報(bào)道。
　　 目的:
　　 本課題擬在闡明糖尿病發(fā)病過程中eNOS/NO信號(hào)通路和miR-155表達(dá)是否有異常變化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析miR-155的表達(dá)異常對(duì)eNOS的調(diào)控作用及其機(jī)制。擬從microRNA這一

6、新的角度尋找防治糖尿病血管合并癥的新靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.STZ腹腔注射雄性Wistar大鼠誘導(dǎo)糖尿病模型，觀察4周糖尿病大鼠與正常大鼠主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿和硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)的差異。
　　 2.Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)4周糖尿病大鼠和對(duì)照組兩組之間eNOS蛋白和mRNA表達(dá)的差異。
　　 3.檢測(cè)高糖對(duì)HUVEC eNOS蛋白、mRNA表達(dá)以及eNOS活性和NO

7、生成的影響。
　　 4.放線菌素D處理抑制HUVEC轉(zhuǎn)錄，熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR觀察高糖不同時(shí)程后eNOS mRNA穩(wěn)定性的變化。
　　 5.熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)高糖對(duì)miR-155表達(dá)的變化。
　　 6.pCDNA3-eNOS-3UTR和pCS2-miR155質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染cos7細(xì)胞，Western blot檢測(cè)pCS2-miR155對(duì)外源eNOS表達(dá)的影響。
　　 7.Luc-eNOS-3UT

8、R質(zhì)粒與pCS2-miR155共轉(zhuǎn)染cos7細(xì)胞24h，測(cè)定pCS2-miR155對(duì)熒光素酶活性的影響。
　　 8.Western blot檢測(cè)ad-miR155腺病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)HUVEC內(nèi)源性eNOS表達(dá)的影響。
　　 9.放線菌素D抑制HUVEC轉(zhuǎn)錄后，熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ad-miR155轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組之間eNOS mRNA表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.糖尿病組大鼠乙酰膽堿引起的主動(dòng)

9、脈血管舒張反應(yīng)與正常對(duì)照組相比顯著降低，而硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)在兩組間無(wú)明顯差異。反映糖尿病時(shí)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)降低，而非內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)無(wú)變化，提示eNOS/NO信號(hào)通路存在異常。
　　 2.糖尿病大鼠主動(dòng)脈eNOS蛋白和mRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，提示eNOS的表達(dá)變化參與了糖尿病內(nèi)皮功能障礙。
　　 3.高糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h后，eNOS蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)eNOS的活性亦明顯

10、下降。提示高糖環(huán)境可通過抑制eNOS的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而降低eNOS的活性，減少NO的生成。
　　 4.轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin D處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，隨高糖作用時(shí)間的增加，eNOS mRNA降解加快，半衰期降低。提示高糖環(huán)境可促進(jìn)eNOS mRNA的降解，降低eNOS mRNA穩(wěn)定性。
　　 5.高糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞1h后，miR-155表達(dá)即開始增高，4h達(dá)到最大效應(yīng)。
　　 6.Cos7細(xì)胞共

11、轉(zhuǎn)染pCS2-miR155和pcDNA3-eNOS-3'UTR質(zhì)粒后，western blot結(jié)果顯示miR155可劑量依賴性降低eNOS表達(dá)。
　　 7.在Cos7細(xì)胞，pCS2-miR155轉(zhuǎn)染后可劑量依賴性降低含3'端非翻譯區(qū)的eNOS報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)活性。
　　 8.在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，miR155轉(zhuǎn)染可促進(jìn)eNOS mRNA的降解，進(jìn)而劑量依賴性抑制內(nèi)源性eNOS表達(dá)。
　　 結(jié)論: