MiR-155參與糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙及其機制.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病(Diabetes melintus,DM)已成為威脅人類健康的一大類疾病，其發(fā)病率逐年增加，發(fā)病年齡日趨年輕化。DM患者晚期常死于各類并發(fā)癥，其中大血管和微血管病變是致死、致殘的主要原因。已有研究表明，內(nèi)皮細胞功能的異常變化在糖尿病血管病變過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　 血管內(nèi)皮通過釋放舒張和收縮因子調(diào)節(jié)血管的基礎(chǔ)張力以及生理、病理狀態(tài)下血管對機械張力和神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)性，在血管功能的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮

2、了重要作用。其中，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)生成的NO是調(diào)控血管舒張反應(yīng)的最重要因素。而且，越來越多的證據(jù)表明，NO不僅參與血管張力的調(diào)節(jié)，還具有抑制血小板聚集，降低內(nèi)皮細胞的通透性，抑制單核細胞和白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附以及抑制平滑肌細胞增殖和遷移等功能，說明eNOS/NO通路在維持心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用。
　　 大量的動物實驗和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮

3、依賴性舒張反應(yīng)降低是糖尿病發(fā)病早期的標志性變化。盡管糖尿病內(nèi)皮功能損害是多因素綜合作用的結(jié)果，但eNOS/NO通路的異常是導(dǎo)致內(nèi)皮損害最主要的原因。在血管內(nèi)皮細胞，NO的合成依賴于eNOS的活性和表達水平。因此，深入探討糖尿病發(fā)病過程中eNOS的活性和表達異常變化的機制，對尋找防治糖尿病血管合并癥的新靶點具有重要意義。
　　 MicroRNA是最近發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性保守非編碼RNA小分子，大小約22個核苷酸左右，它通過與目標mRN

4、A3'端非翻譯區(qū)配對降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因的表達。近期大量研究報導(dǎo)了MicroRNA廣泛參與了糖尿病相關(guān)過程的調(diào)控，包括胰島素分泌、胰腺發(fā)育、β細胞分化，糖代謝、脂代謝等。在血管內(nèi)皮細胞，已往研究表明MicroRNA參與調(diào)控了細胞的多種功能，如血管生成和炎癥反應(yīng)等。但microRNA是否參與調(diào)控糖尿病內(nèi)皮功能障礙和血管合并癥的發(fā)生，尚不清楚。miR-155位于非編碼基因Bic內(nèi)，在血液細胞中高表達。已有研

5、究表明miR-155參與調(diào)控T淋巴細胞、B淋巴細胞和樹突狀細胞的分化，從而影響機體的免疫功能。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在內(nèi)皮細胞有表達，可溶性CD40分子和TNFα可上調(diào)其表達，但其在內(nèi)皮細胞中的功能尚未見報道。
　　 目的:
　　 本課題擬在闡明糖尿病發(fā)病過程中eNOS/NO信號通路和miR-155表達是否有異常變化的基礎(chǔ)上，進一步分析miR-155的表達異常對eNOS的調(diào)控作用及其機制。擬從microRNA這一

6、新的角度尋找防治糖尿病血管合并癥的新靶點。
　　 方法:
　　 1.STZ腹腔注射雄性Wistar大鼠誘導(dǎo)糖尿病模型，觀察4周糖尿病大鼠與正常大鼠主動脈對乙酰膽堿和硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)的差異。
　　 2.Western blot和實時熒光定量RT-PCR檢測4周糖尿病大鼠和對照組兩組之間eNOS蛋白和mRNA表達的差異。
　　 3.檢測高糖對HUVEC eNOS蛋白、mRNA表達以及eNOS活性和NO

7、生成的影響。
　　 4.放線菌素D處理抑制HUVEC轉(zhuǎn)錄，熒光實時定量RT-PCR觀察高糖不同時程后eNOS mRNA穩(wěn)定性的變化。
　　 5.熒光實時定量RT-PCR檢測高糖對miR-155表達的變化。
　　 6.pCDNA3-eNOS-3UTR和pCS2-miR155質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染cos7細胞，Western blot檢測pCS2-miR155對外源eNOS表達的影響。
　　 7.Luc-eNOS-3UT

8、R質(zhì)粒與pCS2-miR155共轉(zhuǎn)染cos7細胞24h，測定pCS2-miR155對熒光素酶活性的影響。
　　 8.Western blot檢測ad-miR155腺病毒載體轉(zhuǎn)染對HUVEC內(nèi)源性eNOS表達的影響。
　　 9.放線菌素D抑制HUVEC轉(zhuǎn)錄后，熒光實時定量RT-PCR檢測ad-miR155轉(zhuǎn)染組與對照組之間eNOS mRNA表達的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.糖尿病組大鼠乙酰膽堿引起的主動

9、脈血管舒張反應(yīng)與正常對照組相比顯著降低，而硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)在兩組間無明顯差異。反映糖尿病時內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)降低，而非內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)無變化，提示eNOS/NO信號通路存在異常。
　　 2.糖尿病大鼠主動脈eNOS蛋白和mRNA表達均明顯低于對照組，提示eNOS的表達變化參與了糖尿病內(nèi)皮功能障礙。
　　 3.高糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞24h后，eNOS蛋白和mRNA表達水平顯著降低，同時eNOS的活性亦明顯

10、下降。提示高糖環(huán)境可通過抑制eNOS的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進而降低eNOS的活性，減少NO的生成。
　　 4.轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin D處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞后，隨高糖作用時間的增加，eNOS mRNA降解加快，半衰期降低。提示高糖環(huán)境可促進eNOS mRNA的降解，降低eNOS mRNA穩(wěn)定性。
　　 5.高糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞1h后，miR-155表達即開始增高，4h達到最大效應(yīng)。
　　 6.Cos7細胞共

11、轉(zhuǎn)染pCS2-miR155和pcDNA3-eNOS-3'UTR質(zhì)粒后，western blot結(jié)果顯示miR155可劑量依賴性降低eNOS表達。
　　 7.在Cos7細胞，pCS2-miR155轉(zhuǎn)染后可劑量依賴性降低含3'端非翻譯區(qū)的eNOS報告基因熒光素酶的表達活性。
　　 8.在人臍靜脈內(nèi)皮細胞，miR155轉(zhuǎn)染可促進eNOS mRNA的降解，進而劑量依賴性抑制內(nèi)源性eNOS表達。
　　 結(jié)論: