血管內(nèi)皮功能障礙中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的建立與絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙的病理生理機(jī)制及通絡(luò)藥物干預(yù)研究.pdf

1、目的：本研究以絡(luò)病理論為指導(dǎo)，建立血管內(nèi)皮功能障礙的中醫(yī)證候量化辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)上建立絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，探討“絡(luò)氣虛滯”狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能障礙變化、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂及兩者的內(nèi)在聯(lián)系，同時(shí)觀察病證復(fù)合模型動(dòng)物血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)及單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，研究絡(luò)氣虛滯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用并探索不同類別通絡(luò)藥物的作用機(jī)制，為絡(luò)病理論指導(dǎo)血管病變防治提

2、供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1. 血管內(nèi)皮功能障礙中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的建立 通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研、專家咨詢、中醫(yī)四診信息的分級(jí)賦分確立“血管內(nèi)皮功能障礙中醫(yī)證候臨床調(diào)查表”，并進(jìn)行臨床流行病學(xué)調(diào)查。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40歲以上；②至少具備下列診斷中的一項(xiàng)：?jiǎn)渭兏哐獕骸⒀惓?、超重或肥胖、吸煙、代謝綜合征人群；③一氧化氮(NO)<59 umol/L，及內(nèi)皮素(ET)>53.38 pg/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、腦、腎、神經(jīng)、眼底等靶器

3、官損傷者；②嚴(yán)重肝、腎功能不全者；③妊娠或哺乳期婦女、精神病患者。調(diào)查由專人負(fù)責(zé)，用Epidata3.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)。將400例入選病人，隨機(jī)分為甲、乙兩組，甲組300例，乙組100例，甲組用于建立量化辨證分型標(biāo)準(zhǔn)及對(duì)量化辨證分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回顧性檢驗(yàn)，乙組用于量化辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的前瞻性檢驗(yàn)。將甲組300例臨床調(diào)查資料，采用基于熵的復(fù)雜系統(tǒng)分劃方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，按癥狀聚堆結(jié)果，提取血管內(nèi)皮功能障礙各證型的中醫(yī)癥狀信息，歸納各證型，并計(jì)算各

4、證型中的癥狀對(duì)相應(yīng)證型的貢獻(xiàn)分值，采用診斷性試驗(yàn)中的接受者操作特性曲線(ROC曲線)分析方法，結(jié)合專業(yè)知識(shí)，確定各證型的診斷閾值。根據(jù)臨床流行病學(xué)診斷性試驗(yàn)研究方法，進(jìn)行量化辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的回顧性和前瞻性檢驗(yàn)。分析各證型之間的關(guān)聯(lián)度，歸納各證型組合規(guī)律及病機(jī)轉(zhuǎn)趨規(guī)律。 2. 絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型的建立及通絡(luò)藥物干預(yù)研究 依據(jù)上述臨床流行病學(xué)調(diào)查確立的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，以中醫(yī)“勞則氣耗”、“饑則損氣”理論為指導(dǎo)，在高蛋

5、氨酸(HCY)飲食建立血管內(nèi)皮功能障礙大鼠模型基礎(chǔ)上，疊加“基礎(chǔ)進(jìn)食+強(qiáng)迫負(fù)重游泳”絡(luò)氣虛滯證候因素建模。將清潔級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為以下7組，每組15只：(1) 對(duì)照組；(2) 血管內(nèi)皮功能障礙模型組(HCY組)；(3) 復(fù)合模型組(絡(luò)氣虛滯證候+HCY)；(4) 人參(復(fù)合模型+人參)；(5) 四味通絡(luò)組(復(fù)合模型+四味通絡(luò)方)；(6) 通心絡(luò)組(復(fù)合模型+通心絡(luò)超微粉)；(7) 貝那普利組(復(fù)合模型+貝那普利)。從模型大鼠

6、的生物學(xué)表征、血管內(nèi)皮病理組織形態(tài)學(xué)、血管內(nèi)皮的生化功能等方面對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，同時(shí)運(yùn)用單味藥物(人參)、組分配伍藥物(四味通絡(luò)方)、復(fù)方通絡(luò)藥物(通心絡(luò))干預(yù)，并與貝那普利進(jìn)行對(duì)照研究，觀察不同層次通絡(luò)藥物對(duì)復(fù)合模型的作用。 3. 絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)變化及通絡(luò)藥物干預(yù)研究 本研究應(yīng)用絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)：血清去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(

7、E)的水平(ELISA法)；下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)：血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和血清皮質(zhì)酮(CORT)的水平(放射免疫分析法)；腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)：血漿腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)的水平(放射免疫分析法)；免疫系統(tǒng)：血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)的水平(放射免疫分析法)等，反應(yīng)NEI網(wǎng)絡(luò)的功能變化。運(yùn)用典

8、型相關(guān)分析，對(duì)NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子與內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)：ET、NO、血管性假血友病因子(vWF)進(jìn)行相關(guān)性分析，并觀察通絡(luò)藥物的干預(yù)作用。 4. 病證復(fù)合模型大鼠血清培養(yǎng)HUVEC建立細(xì)胞模型并觀察細(xì)胞骨架蛋改變及通絡(luò)藥物干預(yù)研究 采用絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合模型大鼠血清培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)細(xì)胞株，激光共聚交顯微鏡觀察細(xì)胞骨架

9、蛋白F-actin的形態(tài)、分布，流式細(xì)胞儀檢測(cè)F-actin含量、伊文思藍(lán)標(biāo)記牛血清白蛋白檢測(cè)單層內(nèi)皮通透性變化，Western blot技術(shù)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞骨架蛋白F-actin、p38、磷酸化p38(phospho-p38，p-p38)蛋白表達(dá)和p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化及通絡(luò)藥物干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組:(1) 對(duì)照組:無(wú)血清培養(yǎng)基(F12

10、K)中加入終濃度為20％的胎牛血清:(2) 正常血清組:無(wú)血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20％的正常大鼠血清；(3) 復(fù)合模型血清組:無(wú)血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20％的復(fù)合模型大鼠血清；(4) 人參組:于無(wú)血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入人參(終濃度:1μg/ml)孵育，2h后加入20％復(fù)合模型大鼠血清；(5) 四味通絡(luò)組:于無(wú)血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入四味通絡(luò)方(終濃度:100μg/ml)孵育，2h后加入20％復(fù)合

11、模型大鼠血清。(6) 通心絡(luò)組:于無(wú)血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入通心絡(luò)超微粉(終濃度:1μg/ml)孵育，2h后加入20％復(fù)合模型大鼠血清；(7) SB203580組:于無(wú)血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入SB203580(p38阻斷劑，終濃度:25umol/L)孵育，1h后加入20％復(fù)合模型大鼠血清。加入血清后各組培養(yǎng)時(shí)間為2h、6h、12h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。 結(jié)論： 1. 首次建立血管內(nèi)皮功能障礙中醫(yī)證候量化辨證分型

12、標(biāo)準(zhǔn) 在國(guó)內(nèi)首次采用臨床流行病學(xué)調(diào)查方法，將基于熵的復(fù)雜系統(tǒng)分劃方法應(yīng)用于血管內(nèi)皮功能障礙中醫(yī)證候辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的研究。研究結(jié)果顯示，該方法適用于中醫(yī)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)的研究，為中醫(yī)證候的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化研究提供了新思路與新方法。首次建立了血管內(nèi)皮功能障礙的中醫(yī)證候量化辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，本病可分為絡(luò)氣虛滯、絡(luò)氣郁滯兩大基本證型，同時(shí)可兼夾痰濕、郁熱、陰虛、陽(yáng)虛、痰熱、血瘀等證。絡(luò)氣郁滯或虛滯在血管內(nèi)皮功能障礙中占有重要地位。 2. 建

13、立絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合動(dòng)物模型 依據(jù)臨床流行病學(xué)調(diào)查確立的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，以中醫(yī)“勞則氣耗”、“饑則損氣”理論為指導(dǎo)，在高蛋氨酸飲食建立血管內(nèi)皮功能障礙模型基礎(chǔ)上，疊加“基礎(chǔ)進(jìn)食+強(qiáng)迫負(fù)重游泳”，成功建立了絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合大鼠模型，為深入研究其病理生理機(jī)制提供了可靠的基礎(chǔ)。 3. 絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型大鼠存在NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂并與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān) 復(fù)合模型大鼠NEI

14、網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子存在異常改變，具體表現(xiàn)為交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)功能亢進(jìn)、HPAA功能抑制、RAAS功能亢進(jìn)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子IL-1β升高、IL-2下降，提示復(fù)合模型大鼠存在NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂。絡(luò)氣虛滯證候因素在復(fù)合模型大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂中起著重要作用。典型相關(guān)分析顯示，復(fù)合模型大鼠血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)指標(biāo)與NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子之間具有相關(guān)性，具體反映在NO、vWF和ACTH、NE、CORT、IL-2、CRH之間互相影響。上述研究提示，

15、NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂可能是絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制之一。 4. 首次建立絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙細(xì)胞模型 采用病證復(fù)合大鼠模型血清培養(yǎng)HUVEC，模擬病證復(fù)合損傷因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，復(fù)合模型內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin含量降低、解聚和重新分布，單層細(xì)胞通透性增高，其機(jī)制可能與p38 MAPK信號(hào)通路激活有關(guān)。 5. 通絡(luò)藥物對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙的整合調(diào)節(jié)作用 不同類

16、別的通絡(luò)藥物干預(yù)，均可明顯改善復(fù)合模型大鼠絡(luò)氣虛滯證候表現(xiàn)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)損傷，調(diào)整內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子的變化；改善交感神經(jīng).腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)、HPAA、RAAS、免疫系統(tǒng)的功能紊亂。其中以復(fù)方通心絡(luò)作用最明顯，提示不同通絡(luò)藥物的科學(xué)組方在保護(hù)內(nèi)皮功能方面發(fā)揮出整合調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)。 體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，復(fù)方通心絡(luò)可改善F-actin的形態(tài)與分布，提高F-actin含量，進(jìn)而降低內(nèi)皮通透性，保護(hù)血管內(nèi)皮，其機(jī)制與抑制p38MAPK信號(hào)通