銀杏葉提取物（GBE50）預(yù)防血管內(nèi)皮功能障礙的體外實驗研究.pdf

1、第一部分 銀杏葉提取物GBE50(及其主成分總黃酮)對缺氧致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及ROS生成的作用 目的：觀察銀杏葉提取物GBE50及其主成分總黃酮對缺氧致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成及凋亡的保護(hù)作用。 方法：通過消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVECs)，傳代后干預(yù)分組如下：N組(正常對照)，H組(缺氧24h)，HG組(缺氧前GBE50干預(yù)4h)和HF組(缺氧前總黃酮干預(yù)4h)，其中GBE50和總黃酮各有3個濃度：12

2、.5、25及50μg/ml。采用流式細(xì)胞儀測各組ROS(活性氧)水平及早期凋亡率(AnnexinV)，通過TUNEL，測晚期凋亡率，探討缺氧及GBE50和總黃酮對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其ROS生成的影響。 結(jié)果： 1.H組ROS水平較N組明顯增加，由(9.88±0.97)％升至(29.27±2.21)％，有顯著性差異(P<0.05)；HG各濃度組與H組相比ROS水平均下降，但與N組及H組相比均無明顯差異(P>0.05)；HF 各

3、濃度組與H組相比ROS水平均明顯下降(P<0.05)，其中總黃酮濃度為50μg/ml時ROS水平降至最低，為(7.42±1.81)％。 2.H組細(xì)胞AnnexinV陽性率較N組明顯增加，由(9.00±1.00)％升至(18.47±2.53)％，有顯著性差異(P<0.05)；HG25μg/ml時為(10.69±2.08)％，顯著降低了內(nèi)皮細(xì)胞的AnnexinV陽性率(P<0.05)；HF 各濃度組均能不同程度地降低AnnexinV

4、陽性率，但尚無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，該保護(hù)效應(yīng)在總黃酮濃度為50μg/ml時最明顯，AnnexinV陽性率為(14.25±2.22)％。 3.H組 TUNEL，陽性率較N組明顯增加，由(1.28±0.65)％升至(8.59±1.10)％，有顯著性差異(P<0.05)；HG 25μg/ml 時降至(3.58±0.28)％，HF50μg/ml為(3.06±0.40)％，較H組均明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論：缺氧可導(dǎo)

5、致HUVEC ROS生成增加伴凋亡增多。而GBE 50及總黃酮可降低缺氧所致的ROS生成增多及凋亡增加，GBE50及總黃酮對缺氧所致的內(nèi)皮功能障礙有一定的保護(hù)作用。 第二部分 銀杏葉提取物GBE50對抗缺氧致內(nèi)皮功能障礙的影響及部分機(jī)制探討 目的：初步探討銀杏葉提取物GBE50對抗缺氧致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的分子機(jī)制。 方法：通過消化法獲得HUVEC，傳代后干預(yù)分組如下：N組(正常對照)，NG組(GBE50 25

6、μg/ml干預(yù)4h后不予缺氧處理)，H 組 (缺氧24h)及HG組(GBE5025μg/ml干預(yù)4h后缺氧24h)。應(yīng)用RT-PCR半定量檢測各組vWF(von Willebrand因子)、ET-1 (內(nèi)皮素-1) 及PPAR γ (過氧化物酶體增殖物激活受體γ)的mRNA表達(dá)水平，運(yùn)用Western-blot測各組eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)及PPAR γ的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.vWF的mRNA表達(dá)水平：N組為

7、(0.55±0.05)％，H組為(0.84±0.14)％，H組vwF表達(dá)較N組明顯增加 (P<0.05)；HG組為(0.58±0.24)％，與H組相比明顯降低(P<0.05)。 2.ET-1的mRNA表達(dá)水平：N組為(0.14±0.03)％，H組為(0.31±0.03)％，H組ET-1 表達(dá)較N組明顯增加(P<0.05)；HG為(0.26±0.02)％，與H組相比明顯降低(P<0.05)。 3.eNOS蛋白表達(dá)水平：H組

8、eNOS蛋白表達(dá)較N組明顯增加，由(0.30±0.04)％升至(0.59±0.08)％，有顯著性差異(P<0.05)；HG組降至(0.43±0.08)％，但與其它各組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 4.PPAR γ的mRNA表達(dá)水平：N組為(0.40±0.02)％，H組為(0.42±0.01)％，HG組為(0.42±0.01)％，各組之間無差異(P>0.05)。5.PPARγ的蛋白表達(dá)水平：N組為(0.10±0.02)％，H

9、組為(0.13±0.05)％，HG組為(0.13±0.04)％，各組相比無改變(P>0.05)。結(jié)論內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷時可導(dǎo)致ET-1、vWF及eNOS的表達(dá)增加，內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧前給予GBE50 25μg/ml后，可降低缺氧導(dǎo)致的ET-1、vWF的表達(dá)增加，部分降低因缺氧導(dǎo)致的eNOS蛋白表達(dá)的增高，提示缺氧及GBE50對上述因子的表達(dá)起作用。缺氧及GBE50對PPAR γ的mRNA及蛋白水平均無影響，提示缺氧及GBE50不通過PPARγ

10、途徑起作用。 第三部分 銀杏葉提取物GBE50在缺氧致內(nèi)皮功能障礙中抗凋亡作用的初步研究 目的： 探討銀杏葉提取物GBESO對缺氧致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號分子mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。 方法：應(yīng)用人細(xì)胞凋亡基因表達(dá)譜cDNA芯片篩選出凋亡通路上的差異表達(dá)基因譜，再運(yùn)用RT-PCR對部分差異基因進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1.基因芯片結(jié)果：缺氧干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞24小時后，H組(缺氧24h)較N組(正常對

11、照)上調(diào)了15個基因；而HG組(缺氧前4h予GBE 50 25μg/ml進(jìn)行干預(yù))較N組上調(diào)了38個基因，下調(diào)了69個基因。 2.RT-PCR驗證結(jié)果：內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)缺氧損傷后，ATM(毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因)的mRNA表達(dá)由N組的(0.40±0.01)％升至H組的(0.47±0.og)％，H組較N組明顯增加(P<0.05)；HG組則降至(0.23±0.11)％，較H組明顯降低(P<0.05)。TNFSF10(腫瘤壞死因子