綠茶多酚對高脂誘導(dǎo)的代謝紊亂和血管內(nèi)皮功能障礙的影響.pdf

1、第一部分：綠茶多酚對高脂誘導(dǎo)代謝紊亂的影響
　　目的:觀察高脂膳食對大鼠代謝指標(biāo)的影響和肝臟脂肪沉積以及肝臟糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響,并觀察綠茶多酚對高脂膳食誘導(dǎo)的代謝改變、肝臟脂肪沉積和糖脂代謝基因表達(dá)改變的干預(yù)效果。
　　方法:體重40-60g斷乳雄性Wistar大鼠50只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,分為5組,對照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料,高脂組和三個(gè)綠茶多酚干預(yù)組給予高脂飼料,實(shí)驗(yàn)開始時(shí)所有大鼠飲用去離子水,綠茶多酚干預(yù)組在達(dá)到成年體

2、重后改為飲用不同濃度的綠茶多酚水溶液,第26周進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT),26周末,處死大鼠,分離血清。用ELISA檢測血清中胰島素的含量;用生化試劑盒檢測血糖、血脂水平,計(jì)算HOMA-IR指數(shù);精確稱量肝臟、睪周脂肪和腎周脂肪的重量,計(jì)算內(nèi)臟脂肪系數(shù)和肝臟系數(shù);取部分肝臟組織冰凍切片,進(jìn)行油紅O染色。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測肝臟組織中脂肪合成酶(FAS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCoAR)、過氧化物酶體增殖物激活

3、受體α(PPARα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:對照組大鼠進(jìn)食量顯著高于其它組,但是各組大鼠能量攝入量沒有顯著差異。自第9周開始,高脂組大鼠體重顯著高于對照組,這種差異持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),高脂組大鼠體重和內(nèi)臟脂肪系數(shù)都顯著高于對照組,與高脂組相比,綠茶多酚干預(yù)組大鼠的體重

4、和內(nèi)臟脂肪系數(shù)都顯著降低。與對照組相比,高脂組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平,胰島素抵抗指數(shù)和OGTT試驗(yàn)曲線下面積都顯著升高,綠茶多酚干預(yù)降低了高脂飼養(yǎng)大鼠的血糖水平,胰島素抵抗指數(shù)和OGTT試驗(yàn)曲線下面積,但是對胰島素水平?jīng)]有明顯影響。高脂飼養(yǎng)導(dǎo)致了大鼠血脂紊亂,其中血清甘油三酯(TG),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總膽固醇(TC)水平與對照組相比顯著升高,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著下降,LDL-C/HDL-C

5、值顯著上升,綠茶多酚干預(yù)降低了高脂飼養(yǎng)大鼠血清TG、TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C的水平,但是對HDL-C的水平?jīng)]有明顯影響。高脂飼養(yǎng)引起了大鼠肝臟脂肪沉積,肝臟系數(shù)升高,并引起了肝臟中糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)改變,其中脂肪合成相關(guān)的基因FAS、HMG-CoAR和SREBP-1和糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK和G6Pase的mRNA表達(dá)水平顯著升高,脂肪酸氧化相關(guān)的基因PPARα和肝臟中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT2的mRNA表達(dá)水平

6、顯著降低。綠茶多酚干預(yù)降低了高脂飼養(yǎng)大鼠的肝臟系數(shù)和肝臟脂肪沉積,并抑制了高脂誘導(dǎo)的大鼠肝臟糖脂代謝基因表達(dá)改變。
　　結(jié)論:高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠發(fā)生代謝紊亂,肝臟脂肪沉積和糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)異常,這些改變與能量攝入無關(guān);綠茶多酚干預(yù)能夠預(yù)防和改善高脂誘導(dǎo)的代謝紊亂和肝臟脂肪沉積。
　　第二部分：綠茶多酚對脂聯(lián)素水平的影響及細(xì)胞信號機(jī)制
　　目的:綠茶多酚的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制到目前為止尚不清楚。脂聯(lián)素被認(rèn)為是肥胖和胰島素抵抗

7、治療的新靶點(diǎn)。本部分主要觀察綠茶多酚對高脂飼養(yǎng)大鼠脂聯(lián)素水平的影響并探索相關(guān)機(jī)制。
　　方法:動(dòng)物飼養(yǎng)與干預(yù)同第一部分,血清脂聯(lián)素水平采用ELISA方法檢測,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素和PPARγ的mRNA表達(dá)水平,采用免疫印跡法檢測PPARγ,磷酸化PPARγ,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。采用高糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠內(nèi)臟脂肪組織,并進(jìn)行綠茶多酚進(jìn)行干預(yù)和ERK1/

8、2的特異性抑制劑PD98059進(jìn)行預(yù)處理。干預(yù)24h后,收集培養(yǎng)液,檢測其中的脂聯(lián)素水平,收集培養(yǎng)的內(nèi)臟脂肪組織檢測脂聯(lián)素和PPARγ的mRNA表達(dá)水平以及PPARγ,磷酸化PPARγ,ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:高脂組大鼠脂聯(lián)素mRNA水平和血清脂聯(lián)素水平都顯著低于對照組,而綠茶多酚干預(yù)顯著升高了脂聯(lián)素水平。與對照組相比,高脂組大鼠內(nèi)臟脂肪中ERK1/2的激活和PPARγ的磷酸化顯著升高,而PPA

9、Rγ的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低,與高脂組相比,綠茶多酚干預(yù)組ERK1/2和PPARγ磷酸化水平顯著降低,而PPARγ表達(dá)水平顯著升高。采用高糖體外培養(yǎng)內(nèi)臟脂肪組織也顯著降低了內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA水平,分泌到培養(yǎng)液中的脂聯(lián)素水平和PPARγ的表達(dá)水平,而上調(diào)了ERK1/2和PPARγ的磷酸化水平。而綠茶多酚干預(yù)和ERK1/2抑制劑處理均能抑制高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)的這些改變。
　　結(jié)論:上調(diào)脂聯(lián)素水平是綠茶多酚抑制高脂飲食誘

10、導(dǎo)代謝紊亂的重要機(jī)制之一。綠茶多酚通過抑制ERK1/2的激活,降低PPARγ的磷酸化水平和上調(diào)PPARγ表達(dá)水平來上調(diào)脂聯(lián)素的水平。
　　第三部分：綠茶多酚對血管內(nèi)皮高通透性的影響及機(jī)制
　　目的:觀察高脂飼料飼養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮通透性的改變和綠茶多酚的干預(yù)效果,并在體內(nèi)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探索綠茶多酚調(diào)控通透性改變的機(jī)制。
　　方法:動(dòng)物飼養(yǎng)與干預(yù)同第一部分,牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAECs)采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),分別采用綠茶多

11、酚,二苯基碘(DPI)、SU5416(VEGF受體2抑制劑)、rhVEGF和β環(huán)糊精(胞膜窖結(jié)構(gòu)抑制劑)進(jìn)行干預(yù)后,檢測單層BAECs通透性。大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮通透性采用伊文思藍(lán)注射法測定,單層BAECs通透性利用穿過細(xì)胞的異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐測定。采用二氫乙啶(DHE)熒光探針檢測大鼠主動(dòng)脈活性氧(ROS)水平,采用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針檢測細(xì)胞中的ROS水平。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測V

12、EGF和窖蛋白1的mRNA表達(dá)水平,采用ELISA檢測大鼠血清和細(xì)胞培養(yǎng)液中的VEGF水平,采用蛋白免疫印跡法檢測培養(yǎng)的BAECs中的cav-1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與對照組相比,高脂組大鼠主動(dòng)脈通透性顯著升高,與高脂組相比,綠茶多酚干預(yù)組主動(dòng)脈通透性顯著降低。高脂膳食顯著上調(diào)了大鼠的血清VEGF水平、主動(dòng)脈中VEGF的mRNA表達(dá)水平和主動(dòng)脈中的ROS水平,而綠茶多酚干預(yù)顯著抑制了高脂誘導(dǎo)VEGF和ROS水平的升高。采用高糖

13、培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BAECs,顯著上調(diào)了單層BAECs的通透性、VEGF的表達(dá)和分泌水平、以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平,同時(shí)還上調(diào)了NADPH氧化酶亞基p22phox和p67phox亞基的表達(dá)水平,并誘導(dǎo)了窖蛋白1表達(dá)水平升高,而綠茶多酚顯著改善了高糖誘導(dǎo)的BAECs通透性、VEGF的表達(dá)和分泌水平、ROS、NADPH氧化酶亞基和窖蛋白1表達(dá)水平的升高。與高糖培養(yǎng)類似,rhVEGF預(yù)處理顯著升高了普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的單層BAECs的的通透性,而VEGF

14、受體抑制劑SU5416預(yù)處理、NADPH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理和檢測前采用胞膜窖結(jié)構(gòu)抑制劑β環(huán)糊精孵育都顯著降低了高糖培養(yǎng)單層BAECs的通透性,SU5416預(yù)處理還顯著降低了窖蛋白1的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:高脂膳食能夠誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮通透性升高,這種效應(yīng)能夠被綠茶多酚有效改善。綠茶多酚調(diào)節(jié)高脂飼養(yǎng)大鼠內(nèi)皮通透性的可能信號途徑為:下調(diào)NADPH氧化酶表達(dá)水平,降低ROS產(chǎn)生,進(jìn)而下調(diào)VEGF水平,降低窖蛋白1的表達(dá)水平,減少胞