冠心平對血管內(nèi)皮功能障礙及其相關(guān)信號干預(yù)的研究.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病指冠狀動脈粥樣硬化使血管腔阻塞，導(dǎo)致心肌缺血，缺氧而引起的心臟病，簡稱冠心病(CHD)。CHD是一種嚴重危害人類健康的常見病，多發(fā)病。在歐美等發(fā)達國家，其死亡率占各類疾病死亡率的首位。據(jù)統(tǒng)計，我國CHD的平均患病率為6.49％，近年來CHD的發(fā)病率和病死率呈快速攀升趨勢，極大的威脅人類健康，并給社會及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。我國疾病監(jiān)測系統(tǒng)資料顯示，90年代以來CHD死亡率一直呈現(xiàn)上升趨勢，1991年死亡率為2

2、5.3/10萬，到1998年已經(jīng)上升到42.7/10萬，7年間上升了50%左右，目前全世界心肌梗塞的死亡率已僅次于癌癥而位居第二。因此，如何有效地防治CHD已成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)的一項重要科研課題。本實驗將在第一部分從整體的角度觀察冠心平對動脈粥樣硬化金黃地鼠血管功能的調(diào)節(jié)，在第二部分從體外細胞分子角度觀察冠心平保護血管內(nèi)皮細胞和抗細胞凋亡的作用。
　　 第一部分、冠心平對動脈粥樣硬化金黃地鼠的影響
　　 采用94%基礎(chǔ)飼

3、料、1%膽固醇、5%豬油配制的高脂飼料喂養(yǎng)金黃地鼠，通過定期的血液指標(biāo)檢測和病理指標(biāo)檢測，建立動脈粥樣硬化金黃地鼠模型。再連續(xù)給予冠心平6周，6周后取血檢測及肝臟、主動脈病理觀察。
　　 第一節(jié)中選取一般指標(biāo)分析模型建立情況，分別從體重，血脂，主動脈病理和肝組織病理方面考察冠心平作用，結(jié)果顯示冠心平可降低高脂飼料喂養(yǎng)后金黃地鼠的體重，同時對于血脂中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白水平有調(diào)節(jié)作用。對高脂飼料造成的肝臟

4、及主動脈損傷有明顯改善作用。
　　 第二節(jié)以動脈粥樣硬化金黃地鼠外周血中激素水平為研究對象，結(jié)果顯示冠心平調(diào)節(jié)高脂飼料喂養(yǎng)后金黃地鼠的氧化應(yīng)激水平，降低外周血清的MDA水平，同時升高SOD水平；冠心平對高脂飼料喂養(yǎng)后金黃地鼠的促凝與纖溶系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，升高外周血中t-PA水平，降低PAI的水平；冠心平對高脂飼料喂養(yǎng)后金黃地鼠的血小板凝聚功能亦有調(diào)節(jié)作用，降低外周血中TXB2水平，升高6-Keto-PGF1α水平，減小了TXB2/

5、6-Keto-PGF1α的比值；此外，冠心平還降低高脂飼料喂養(yǎng)后金黃地鼠外周血中TNF-α水平，升高了NO水平，發(fā)揮炎癥因子調(diào)節(jié)作用。
　　 第三節(jié)采用免疫組織化學(xué)方法，考察冠心平對動脈粥樣硬化金黃地鼠主動脈中ICAM-1、TNF-α、NF-κB及IL-10的影響，同時考察對于主動脈凋亡程度的影響。結(jié)果顯示，冠心平可降低高脂飼料喂養(yǎng)后金黃地鼠主動脈組織中ICAM-1、TNF-α、NF-κB的表達水平，對IL-10的表達影響不明顯

6、。同時抗金黃地鼠主動脈組織的凋亡，具有保護主動脈結(jié)構(gòu)的作用。
　　 第二部分、冠心平干預(yù)血管內(nèi)皮細胞損傷的機理研究
　　 本章中采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為研究對象，運用血清藥理學(xué)方法制備兔含藥血清，以含藥血清與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，再以H2O2誘導(dǎo)細胞損傷，采用一系列生化、分子生物技術(shù)考察冠心平對于構(gòu)成血管內(nèi)膜重要組成部分的血管內(nèi)皮細胞在氧化損傷下的影響。
　　 第一節(jié)篩選H2O2合適的損傷濃度。

7、體外培養(yǎng)HUVEC細胞，將H2O2用不含血清的RPMI1640配制成不同的濃度梯度，與HUVEC共培養(yǎng)24h，以MTT法檢測不同濃度下H2O2對HUVEC的損傷程度，以考察出合適的造模濃度。結(jié)果顯示，不同濃度的H2O2與HUVEC共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)H2O2濃度在50-100umol/L時，對HUVEC損傷較為合適。
　　 第二節(jié)考察在冠心平含藥血清干預(yù)下，血管內(nèi)皮細胞在H2O2誘導(dǎo)損傷后，細胞培養(yǎng)液上清中氧化應(yīng)激水平與影響內(nèi)皮細胞功

8、能因子的變化情況，結(jié)果顯示含藥血清與HUVEC共培養(yǎng)后，再加入H2O2共培養(yǎng)24h，冠心平含藥血清可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低細胞培養(yǎng)液上清中MDA水平，并且升高SOD水平，同時，還可以降低培養(yǎng)液上清中ET水平，升高NOS水平。
　　 第三節(jié)利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)考察在冠心平含藥血清干預(yù)下，血管內(nèi)皮細胞在H2O2誘導(dǎo)損傷后，細胞培養(yǎng)液上清中炎性因子水平的變化情況，結(jié)果顯示冠心平含藥血清與HUVEC共培養(yǎng)后，再加入H2O2共培養(yǎng)24h，冠

9、心平含藥血清可以調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，降低細胞培養(yǎng)液上清中IL-1、IL-6和TNF-α水平，減少炎癥因子水平。
　　 第四節(jié)體外培養(yǎng)HUVEC細胞，采用血清藥理學(xué)制備含藥血清，與細胞共培養(yǎng)，將H2O2的不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制為100umol/L濃度，與HUVEC共培養(yǎng)12h，以流式細胞儀法和Hoechst33258熒光染色法檢測冠心平含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡的影響。結(jié)果顯示含藥血清與HUVEC共培養(yǎng)后，

10、再加入H2O2共培養(yǎng)12h，流式細胞儀法結(jié)果冠心平含藥血清可以減少細胞的凋亡率；Hoechst33258熒光染色法結(jié)果顯示冠心平藥物干預(yù)后，細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)的固縮狀態(tài)明顯改善。
　　 第五節(jié)考察冠心平對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型凋亡過程重要蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3的影響，采用免疫組化的方法，原位染色。結(jié)果顯示含藥血清與HUVEC共培養(yǎng)后，再加入H2O2共培養(yǎng)12h，免疫組織化學(xué)法結(jié)果冠心平含