絡氣郁滯型血管內皮功能障礙大鼠動物模型建立及通絡藥物干預作用研究.pdf

1、目的：以絡病理論為指導，依據臨床流行病學調查建立的“脈絡-血管系統(tǒng)病”辨證診斷標準，應用慢性束縛法復合高蛋氨酸飲食建立絡氣郁滯型血管內皮功能障礙病證復合動物模型，從大鼠一般狀況、生物學表征評分、行為學及血管內皮結構與功能等方面對模型進行綜合評價，并觀察神經-內分泌-免疫(NEI)網絡相關因子的改變，應剛通絡復方-組分配伍-單味藥物對動物模型進行不同層次的干預。闡明絡氣郁滯型血管內皮功能障礙的生物學基礎，探討中醫(yī)證候因素在血管內皮功能障礙

2、發(fā)病中的作用，并對通絡藥物干預作用做出綜合評價。 方法： 1. 絡氣郁滯型血管內皮功能障礙動物模型建立與評價 采用慢性束縛法建立絡氣郁滯大鼠證候模型，以高蛋氨酸飲食建立內皮功能障礙大鼠病理模型，基于束縛應激即刻引起血清同型半胱氨酸(HCY)增高、一氧化氮(NO)明顯下降，將慢性束縛法與高蛋氨酸飲食復合建立絡氣郁滯型血管內皮功能障礙病證復合動物模型。將清潔級健康雄性Wistar大鼠40只按體重隨機分為4組：①正常對

3、照組：正常飲食；②絡氣郁滯證候模型組(絡氣郁滯組)：正常飲食，束縛6小時/日；③血管內皮功能障礙病理模型組(病理模型組)：3％蛋氨酸飲食；④絡氣郁滯型血管內皮功能障礙病證復合模型組(復合模型組)：3％蛋氨酸飲食+束縛6小時/日。造模時間為6周。記錄大鼠的一般狀況(精神、皮毛、攝食量、體重)：實驗前后行1％蔗糖水攝取量試驗，實驗末進行生物學表征評分、曠場試驗、尾懸掛試驗。放免法檢測血漿內皮素(ET)，硝酸還原酶法檢測血清NO；光鏡觀察胸主

4、動脈形態(tài)學變化，透射電鏡觀察主動脈組織內皮細胞(EC)超微結構變化；免疫組化法檢測主動脈組織中內皮素-1(ET-1)的表達；循環(huán)酶法測定血清HCY水平。 2. 絡氣郁滯型血管內皮功能障礙模型NEI網絡相關因子變化 實驗動物、分組、造模方法同上，實驗末檢測NEI網絡相關因子：放免法檢測血漿促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、糖皮質激素(CORT)、腎素(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固

5、酮(ALD)及血清中白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)：ELISA法檢測去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、γ，干擾素(γ-INF)、5羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)；計算胸腺和脾臟指數(shù)。 3. 通絡藥物對復合模型干預作用研究 將清潔級健康雄性Wistar大鼠50只按體重隨機分為復合模型組、復方通絡(通心絡)、組分配伍(薤白四味)、單味藥物(薤白有效部位

6、)、貝那普利組共5組，造模方法及造模時間同上，通心絡組為1.2g生藥/Kg/d，薤白四味組為3.47g生藥/Kg/d，薤白組為1.2g生藥/Kg/d，貝那普利組為10mg/Kg/d，連續(xù)灌胃給藥6周；復合模型組按體重灌服0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液。觀察大鼠的生物學表征、血管內皮功能、主動脈組織形態(tài)學及內皮細胞超微結構、NEI網絡相關因子變化，檢測方法同上。 4. 絡氣郁滯型血管內皮功能障礙大鼠主動脈組織葡萄糖調節(jié)

7、蛋白78(GRP78)表達及通絡藥物干預作用 將清潔級健康雄性Wistar大鼠80只按體重隨機分為正常對照組、絡氣郁滯組、病理模型組、復合模型組、通心絡組、薤白四味組、薤白單味組、貝那普利組共8組，造模方法、造模時間及藥物干預同上，實驗末無菌取主動脈組織，利用RT-PCR和Western blot方法檢測各組大鼠主動脈組織葡萄糖調節(jié)蛋白78的基因和蛋白表達。 結論： 1. 絡氣郁滯型血管內皮功能障礙動物模型建立及

8、評價 依據通過臨床流行病學調查建立的絡氣郁滯型內皮功能障礙臨床辨證診斷標準，采用慢性束縛法建立絡氣郁滯大鼠證候模型，以高蛋氨酸飲食建立內皮功能障礙大鼠病理模型，基于束縛應激即刻引起血清HCY增高，NO明顯下降，以“束縛+蛋氨酸飲食”首次建立絡氣郁滯型血管內皮功能障礙病證復合大鼠模型。采用一般狀況觀察、生物學表征評分、行為學指標和血管內皮形態(tài)和功能檢測等半定量和定量檢測方法對上述模型進行綜合評價。研究表明，絡氣郁滯證候模型既表現(xiàn)出

9、明顯的精神萎靡，反應遲鈍，攝食量減少、體重增長緩慢等證候表現(xiàn)，又表現(xiàn)出明顯的內皮形態(tài)和功能的改變，顯示出絡氣郁滯證候因素在血管內皮功能障礙發(fā)病中發(fā)揮重要作用。病理模型僅有內皮形態(tài)和功能改變而無明顯的精神萎靡等癥狀。復合模型大鼠表現(xiàn)出絡氣郁滯證候特征性的同時出現(xiàn)內皮功能障礙，更充分地體現(xiàn)出臨床疾病特點和證候特征信息。 2. 絡氣郁滯型血管內皮功能障礙大鼠NEI網絡的變化特征 通過對正常對照組、絡氣郁滯組、病理模型組、復合模

10、型組大鼠NEI網絡相關因子檢測探討其變化特征，對比分析絡氣郁滯證候因素在血管病變中的重要作用。結果表明與正常對照組比較，絡氣郁滯組、病理模型組、復合模型組均不同程度存在下丘腦-垂體-腎上腺軸、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、單胺類遞質下降，免疫系統(tǒng)能力下降；絡氣郁滯組與復合模型組交感神經-腎上腺髓質系統(tǒng)激活，而病理模型組此系統(tǒng)變化不明顯。與絡氣郁滯組和病理模型組比較，復合模型顯示出絡氣郁滯證和病理模型的非線性疊加效應。揭示既往未被重視

11、的證候因素是血管病變發(fā)生的重要影響因素。NEI網絡相關因子的紊亂可能是絡氣郁滯型血管內皮功能障礙的生物學基礎之一。 3. 通絡藥物對絡氣郁滯型血管內皮功能障礙火鼠的干預作用 以通絡復方(通心絡)、通絡藥物組分配伍(薤白四味)、單味通絡藥物(薤白)分別干預絡氣郁滯型血管內皮功能障礙模型，三個層次通絡藥物均可以改善大鼠的一般狀況及生物學評分，提高蔗糖水攝取量，改善大鼠的情志抑郁癥狀，改善內皮功能，不同程度抑制下丘腦-垂體-腎

12、上腺皮質軸、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經-腎上腺髓質系統(tǒng)的激活，升高單胺類神經遞質，增強免疫功能，調節(jié)NEI網絡。各通絡藥物組改善行為學、內皮功能、NEI網絡指標優(yōu)于對照藥貝那普利，尤其在改善一般狀況和行為學方面，三個層次類通絡藥物作用明顯優(yōu)于貝那普利，其中通心絡作用更為明顯，可能與復方通絡藥物針對血管病變共性病理環(huán)節(jié)配伍有關，在動物模型實驗層面佐證了辨證論治及病、證、法、藥的關聯(lián)性與科學性。通絡干預絡氣郁滯型血管內皮功能障礙

13、模型呈現(xiàn)出通過調節(jié)疾病狀態(tài)下NEI網絡多個系統(tǒng)的紊亂狀態(tài)，重建機體內多個系統(tǒng)之間的自穩(wěn)調控機制，以達到動態(tài)平衡的效應目標，為揭示通絡復方的效應規(guī)律提供思路。 4. 絡氣郁滯型血管內皮功能障礙大鼠主動脈組織葡萄糖調節(jié)蛋白78表達的變化 近來的研究發(fā)現(xiàn)內質網應激，是線粒體應激、核應激的共同通路。內質網應激反應是細胞本身的一種自我保護性機制，但是反應功能障礙或者過強的和長時間的內質網應激都可以引起細胞功能失調，甚至細胞死亡等病