楊樹小GTPase(guanosine triphosphatase)中PtArlAla基因功能的研究.pdf

1、小G蛋白(small GTPase)廣泛的存在于動物、植物和酵母中。通過在結(jié)構(gòu)以及功能上的劃分，可以把小G蛋白家族分為Rab、Rho、Ras、Sar/Arf及Ran五個亞家族。其中Arf亞家族包括Arf GTPase和Arf-like GTPase，而Arf-like GTPase簡稱為Ar1 GTPase，它是多功能的調(diào)節(jié)蛋白，小G蛋白作為分子開關(guān)，結(jié)構(gòu)Ⅰ-Ⅳ是最保守的功能區(qū)之一，起著非常重要的作用。在楊樹方面關(guān)于小G蛋白基因的報道及

2、研究都很少，本實(shí)驗通過生理功能和遺傳機(jī)理等方面來研究楊樹中小G蛋白基因的功能，并且為植物基因工程方面提供了非常重要的基因資源。
　　本試驗是以木本植物-楊樹進(jìn)行研究，通過pBIOZOL法提取楊樹總RNA，設(shè)計特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到了目的基因PtAr1A1a大小為300bp，為了進(jìn)一步研究基因功能，將PtAr1A1a基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pGWB2中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別對楊樹和擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化及侵染，篩選并獲得T0代轉(zhuǎn)

3、基因楊樹和T2代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥，分析研究對轉(zhuǎn)基因植株后代的表現(xiàn)和脅迫應(yīng)答方面的影響。
　　采用200mmol/L NaCl、8％ PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2和干旱等脅迫處理后，分別在2h、12h、24h時間處理的轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明，24h的PtAr1A1a-1轉(zhuǎn)基因楊樹在200mmol/L NaCl和200mmol/L Mannitol處理后的表達(dá)量是2h

4、和12h的2倍，干旱脅迫的PtAr1A1a-1轉(zhuǎn)基因楊樹表達(dá)量，8％ PEG-6000和10mmol/LH2O2脅迫處理在24h的表達(dá)量是2h、12h的0.99倍。
　　對轉(zhuǎn)基因擬南芥中GTP水解能力的測定中，在80mmol/L NaCl、8％ PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2中的水解能力在75min均達(dá)到最大。結(jié)果表明，在80mmol/L NaCl中，此時A1組的水解能力是WT組

5、中的1.19倍和PB2組中的1.39倍。在8％ PEG-6000中，此時A1組的水解能力是WT組中的0.98倍和PB2組中的1.13倍。在200mmol/L Mannitol中，此時A1組的水解能力是WT組中的1.22倍和PB2組中的1.2倍。在10mmol/L H2O2中，此時A1組的水解能力是WT組中的1.01倍和PB2組中的0.9倍。
　　再對比野生型擬南芥(WT)、pGWB2轉(zhuǎn)基因擬南芥(PB2)和A1a轉(zhuǎn)基因擬南芥(A1

6、)分別在80mmol/L NaCl、8％ PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/LH2O2等脅迫處理一周，來驗證PtAr1A1a基因?qū)χ参锏纳L起到的重要作用。結(jié)果表明，WT組、PB2組、A1組三種植株鮮重的變化，在80mmol/L NaCl處理的A1組轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重是分別是WT組的1.35倍，PB2組的1.4倍。在8％PEG-6000處理的A1組轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重是分別是WT組的1.08倍，PB2組

7、的1.21倍。在200mmol/L Mannitol處理的A1組轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重是分別是WT組的1.56倍，PB2組的1.41倍。在10mmol/L H2O2處理的A1組轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重是分別是WT組的1.01倍，PB2組的1.05倍。
　　對轉(zhuǎn)基因擬南芥中電導(dǎo)率的測定，對比WT組、PB2組和A1組擬南芥分別在80mmol/L NaCl、8％ PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2等

8、脅迫處理一周后，結(jié)果說明，在60mmol/LNaCl脅迫后的三組擬南芥對比，A1組受到破壞程度為36.21％，WT為58.33％，PB2組為57.23％。在8％ PEG-6000中，A1組為49.27％，WT為55.76％，PB2組為51.39％。在200mmol/L Mannitol中,A1組為32.21％,WT組為52.27％，PB2組為51.89％。在10mmol/L H2O2中，A1組為49.25％，WT組為52.95％，PB2

9、組為51.12％。
　　對轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素的測定，WT組、PB2組和A1組擬南芥分別在80mmol/L NaCl、8％ PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2等脅迫處理一周后，結(jié)果說明，在80mmol/LNaCl中，A1組是WT組的1.45倍和PB2組的1.55倍。在8％ PEG-6000中，A1組是WT組的0.95倍和PB2組的1.02倍。在200mmol/LMannitol中，A