華支睪吸蟲Rho GTPase基因的發(fā)現(xiàn)及其功能的初步研究.pdf

1、華支睪吸蟲(Clonorchissinensis,Cs)，又稱肝吸蟲(liverfluke)，寄生在人和多種哺乳動物的肝膽管內(nèi)，可引起膽管局限性擴(kuò)張、膽管上皮增生、膽管炎、肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤。全世界將近3500萬人感染華支睪吸蟲，我國目前感染人數(shù)為1249萬，分布在除西北幾個省區(qū)外的25個省市，且呈上升之勢，成為我國一個比較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 因此，華支睪吸蟲病的防治及相關(guān)的基礎(chǔ)研究受到了政府和研究機(jī)構(gòu)的日益重視，通過對

2、華支睪吸蟲基因組和功能基因組的研究尋找有價值的診斷和疫苗候選分子成為華支睪吸蟲病綜合防治的基礎(chǔ)。 本研究從全長cDNA質(zhì)粒文庫中挑選出來一個免疫診斷和疫苗候選分子—華支睪吸蟲RhoGTPase基因。RhoGTPase為一群分子量接近和同源性較高的蛋白，它們廣泛存在于人類、動物、植物以及真菌等生物體內(nèi)，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)，作用于靶蛋白而產(chǎn)生細(xì)胞骨架運(yùn)動、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長和凋亡等多種生物效應(yīng)。在所有的真核生

3、物中，這群高度保守的基因在錯綜復(fù)雜的生化網(wǎng)絡(luò)中控制著細(xì)胞生物活動的基本過程：形態(tài)、極化、運(yùn)動和分裂等等。 華支睪吸蟲RhoGTPase基因首先在本實(shí)驗(yàn)室被克隆和表達(dá)，對其功能和應(yīng)用方面的研究國內(nèi)外都未見報道。 研究目的根據(jù)對CsRhoGTPase基因全長結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析，進(jìn)行克隆、表達(dá)和免疫學(xué)功能初步研究，探討CsRhoGTPase在華支睪吸蟲病診斷和防治上的意義。 研究方法1華支睪吸蟲成蟲CsRhoGTPa

4、se基因及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析從華支睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫中選擇CsRhoGTPase基因，克隆號為CS007c11。利用生物信息學(xué)分析軟件(包括BLASTx、RPS-BLAST、InterProScan、ProtPearamtool等)對CsRhoGTPase的cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析，以及推導(dǎo)的CsRhoGTPase蛋白的理化性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)抗原表位，

5、根據(jù)分析結(jié)果確定表達(dá)策略。 2華支睪吸蟲成蟲CsRhoGTPase基因的擴(kuò)增、克隆和表達(dá) 2.1華支睪吸蟲成蟲CsRhoGTPase基因的擴(kuò)增、克隆根據(jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增CsRhoGTPase基因的cDNA全長編碼區(qū)。用定向克隆方法將其編碼區(qū)cDNA序列連接到質(zhì)粒pET-30a(+)中，用PCR、酶切及測序鑒定。 2.2重組蛋白的表達(dá)純化將重組質(zhì)粒pET-30a

6、(+)-CsRhoGTPase轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，用SDS-PAGE鑒定是否有融合蛋白表達(dá)，親和層析獲得純化的CsRhoGTPase重組蛋白。 3CsRhoGTPase重組蛋白的免疫學(xué)功能初步研究 3.1CsRhoGTPase重組蛋白的免疫反應(yīng)性鑒定將獲得的CsRhoGTPase蛋白，通過SDS-PAGE電泳和Westernblot方法，一抗用感染華支睪吸蟲的貓血清(1：100稀釋)觀察感染血清對

7、重組蛋白的識別能力。 3.2CsRhoGTPase重組蛋白的免疫原性及抗Cs囊蚴的攻擊感染初步研究：用CsRhoGTPase重組蛋白免疫SD大鼠，經(jīng)過基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫后用Cs囊蚴攻擊感染，查見Cs蟲卵后處死大鼠，與對照組比較成蟲數(shù)、蟲卵數(shù)的差異。取血清用ELISA法進(jìn)行血清抗體水平鑒定。 研究結(jié)果1華支睪吸蟲成蟲CsRhoGTPase基因及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析CsRhoGTPase全長基因?yàn)?68bp，ORF從第1

8、12bp到第688bp，起始密碼子為ATG、終止密碼子為TAA，完整閱讀框含576bp，根據(jù)Blastx分析，該ORF就是其完整的CDS，編碼192aa，理論分子量為21，700，pI=7.55(圖1)。BLASTP分析表明，該基因序列與人RhoAGTPase的一致性為70％，同源性為82％；與曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)和日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)的RhoA基因序列一致性分別為66％和

9、68％。同源性分別為79％和80％，并具有與人和其他真核生物RhoGTPases家族一致的特征性序列(GTP酶活性域、Rho插入域及C末端CAAX模序等)，初步判定該基因?yàn)槿A支睪吸蟲RhoGTPase樣基因。 2華支睪吸蟲成蟲CsRhoGTPase基因的擴(kuò)增、克隆和表達(dá)用設(shè)計的引物PCR從質(zhì)粒cDNA文庫中擴(kuò)增CsRhoGTPase編碼區(qū)cDNA序列，用瓊脂糖電泳鑒定在微大于500bp處，測序確定為576bp。定向克隆獲得的重組

10、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-CsRhoGTPase經(jīng)PCR、雙酶切和測序證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG終濃度1mmol/L，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與理論預(yù)測的融合蛋白分子量約30,000相符。 3CsRhoGTPase重組蛋白的免疫學(xué)功能初步研究Westernblot證實(shí)自然感染華支睪吸蟲的貓血清能識別原核表達(dá)的CsRhoGTPase蛋白。初步研究表明，CsRhoGTPase重組蛋白免