大豆GmTLP基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、大豆是重要的油料作物和植物蛋白質(zhì)資源，在食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。大豆花葉病毒病分布非常廣泛，是一種世界性病害，它嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量和外觀品質(zhì)。目前主要通過(guò)適當(dāng)改變播種時(shí)期、選用抗病品種、防蚜治病等措施來(lái)降低大豆花葉病毒(SMV)對(duì)大豆產(chǎn)量的影響，國(guó)內(nèi)外從遺傳工程角度來(lái)探索抗SMV途徑的還很少。類甜味蛋白(Thaumatin-likeproteins，TLP)是第5類植物病程相關(guān)蛋白，在離體條件下具有很強(qiáng)的抑菌抗菌活性。以往關(guān)于類

2、甜味蛋白的抗病研究都限于抗真菌，本研究探討了其與煙草花葉病毒抗性之間的相關(guān)性。GmTLP是本研究從大豆品種科豐1號(hào)中利用SMV誘導(dǎo)的雙向電泳技術(shù)分離克隆的類甜味蛋白編碼基因，在大豆中存在兩個(gè)拷貝，分別命名為GmTLP1和GmTLP2。本文對(duì)GmTLP1在植物中的表達(dá)及功能進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果如下:
　　1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在SMV誘導(dǎo)4h、8h、24h、48h時(shí)，GmTLP1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量明顯上升，說(shuō)明在

3、mRNA水平上該基因是響應(yīng)SMV誘導(dǎo)的，并且響應(yīng)模式為雙峰模式。
　　2、半定量RT-PCR結(jié)果顯示，GmTLP1在大豆根、莖、葉、莢中均有表達(dá)，只是莢中表達(dá)量相對(duì)低一些。
　　3、構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)化空載體PMDC83-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光分布在整個(gè)細(xì)胞中，而在轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒PMDC83-GmTLP1-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞中，細(xì)胞膜部位觀察到

4、有綠色熒光，一定濃度的NaCl使其質(zhì)壁分離后，仍然只在細(xì)胞膜觀察到綠色熒光，說(shuō)明GmTLP1蛋白定位于細(xì)胞膜上。
　　4、基因組PCR、熒光定量PCR、Southernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，GmTLP1被轉(zhuǎn)入煙草中，并在轉(zhuǎn)基因煙草中得到高水平表達(dá)。Southernblot結(jié)果表明，GmTLP1基因以3-4個(gè)拷貝插入煙草基因組中。
　　5、經(jīng)煙草花葉病毒(TMV)接種測(cè)試，過(guò)表達(dá)和反義表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)相反癥狀。GmTLP1基