大豆GmLEC2基因的克隆及再生功能的初步分析.pdf

1、大豆是我國重要的經(jīng)濟(jì)和糧食作物，同時也可作為家畜飼料與工業(yè)原料，并且在醫(yī)學(xué)上也有廣泛的應(yīng)用。近年來，國內(nèi)不斷增長的大豆需求量導(dǎo)致國內(nèi)大豆產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足我國自身的大豆需求。引入基因工程技術(shù)可以大幅度加快大豆品種選育進(jìn)程，對滿足大豆生產(chǎn)需求意義重大。而大豆遺傳轉(zhuǎn)化困難是制約基因功能研究的瓶頸，本論文針對一問題，對影響大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵基因LEC2進(jìn)行了研究。
　　LEC2基因最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥中，是參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生與種子發(fā)育過程

2、的重要轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育與再生過程中起著非常關(guān)鍵的作用。本研究通過同源克隆的方法獲得了大豆GmLEC2基因后，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，同時對該基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位、IPTG誘導(dǎo)蛋白及qRT-PCR組織特異性表達(dá)等實驗，對GmLEC2基因的功能進(jìn)行了初步的驗證。并構(gòu)建了植物表達(dá)載體，進(jìn)行了擬南芥與大豆的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了擬南芥轉(zhuǎn)基因與大豆過表達(dá)植株，并對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型進(jìn)行了初步的分析。主要的實驗結(jié)果如下:
　　1.利

3、用同源克隆技術(shù)獲得了大豆GmLEC2基因。
　　2.利用不同的生物信息學(xué)分析軟件對大豆GmLEC2基因的啟動子元件、蛋白的功能、等電點、脂肪指數(shù)、親水性、不穩(wěn)定系數(shù)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測和分析，并與AtLEC2進(jìn)行了比對分析。結(jié)果表明，GmLEC2基因的啟動子除了包含TATABOX等基本啟動子元件外，還有與植物激素、酶類和植物生長相關(guān)的作用元件;GmLEC2蛋白屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)與信

4、號鈦，并且該蛋白包含一個B3結(jié)構(gòu)域，屬于B3超家族成員。
　　3.構(gòu)建了pCAMBIA1302-GmLEC2載體，并對GmLEC2蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在于細(xì)胞核中，這與預(yù)測的結(jié)果相符。
　　4.構(gòu)建了pET-29b(+)-GmLEC2載體，并使用IPTG對GmLEC2蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)，誘導(dǎo)出的蛋白大小在100 KDa左右。
　　5.采用熒光定量PCR方法對大豆GmLEC2基因進(jìn)行了組織特異性分析，結(jié)果表明G

5、mLEC2基因在大豆未成熟的種子中表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)量最低。
　　6.構(gòu)建了pEARLEY-Gate101-GmLEC2植物表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮侵染法對擬南芥進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PPT篩選與PCR鑒定后，共獲得4株T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。
　　7.對獲得的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)移入營養(yǎng)土4d后，轉(zhuǎn)基因植株并未表現(xiàn)出與野生型擬南芥有較大的差異，植株的發(fā)育良好，但葉片較野生型稍小。移入土