RxLR效應(yīng)分子協(xié)同互作控制大豆疫霉對(duì)寄生侵染過(guò)程.pdf

1、大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根莖腐病是威脅全世界大豆生產(chǎn)的毀滅性的病害之一，每年導(dǎo)致全球高達(dá)十幾億美元的直接經(jīng)濟(jì)損失。大豆疫霉是一類(lèi)營(yíng)半活體營(yíng)養(yǎng)的病原卵菌，在侵染寄主的初期營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)，待成功侵入之后轉(zhuǎn)入死體營(yíng)養(yǎng)階段。因此大豆疫霉的侵染過(guò)程中必然存在著復(fù)雜的分子機(jī)制來(lái)操縱植物的細(xì)胞死亡。目前的研究發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉分泌的RxLR類(lèi)效應(yīng)分子如Avr1b等能夠進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)，抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而促進(jìn)自身的侵入和擴(kuò)

2、展。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)大豆疫霉基因組中RxLR家族效應(yīng)分子有超過(guò)350個(gè)之多，如此眾多的效應(yīng)分子如何在大豆疫霉的致病過(guò)程中相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用目前還缺乏系統(tǒng)的研究。本研究通過(guò)對(duì)大豆疫霉RxLR類(lèi)效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄譜的分析、抑制植物過(guò)敏性細(xì)胞死亡及與之相關(guān)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的功能篩選、不同生理小種間序列多態(tài)性分布等進(jìn)行了多方面的研究，初步闡明了大豆疫霉RxLR家族效應(yīng)分子在大豆疫霉致病過(guò)程中通過(guò)相互協(xié)調(diào)抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制。
　　 大豆疫霉Rx

3、LR類(lèi)效應(yīng)分子的程序化轉(zhuǎn)錄和功能相互作用抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)：本研究對(duì)170個(gè)RxLR效應(yīng)分子的功能進(jìn)行了初步分析。研究中發(fā)現(xiàn)雖然有少數(shù)效應(yīng)分子(11個(gè))能夠直接激發(fā)植物的免疫反應(yīng)，但有超過(guò)75％的效應(yīng)分子對(duì)老鼠細(xì)胞凋亡前體蛋白Bax引起的植物細(xì)胞死亡具有抑制作用，而其中具有C端保守W結(jié)構(gòu)域的RxLR效應(yīng)分子對(duì)Bax觸發(fā)的PCD(BT-PCD)具有更顯著的抑制活性。系統(tǒng)比較分析了W結(jié)構(gòu)域各氨基酸組成與抑制BT-PCD之間的關(guān)系，鑒定了8個(gè)

4、與之相關(guān)的位點(diǎn)。而氨基酸位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明位于W結(jié)構(gòu)域第二個(gè)α螺旋的疏水性氨基酸與抑制BT-PCD的功能顯著相關(guān)。研究中還發(fā)現(xiàn)RxLR效應(yīng)分子的功能與其表達(dá)水平有顯著關(guān)聯(lián)，隨著表達(dá)時(shí)間和表達(dá)豐度的積累，抑制BT-PCD的活性也隨之增強(qiáng)。本文利用MicroArray數(shù)據(jù)對(duì)大豆疫霉的效應(yīng)分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的研究，鑒定出20個(gè)在大豆疫霉侵染前期受誘導(dǎo)高量上調(diào)表達(dá)的效應(yīng)分子。按照這些效應(yīng)分子的表達(dá)豐度和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)進(jìn)行劃分，將其分為三種表達(dá)模式，即侵染

5、前期表達(dá)量持續(xù)較高(Immediately-Early effectors，IE)和侵染早期6-12h受誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(Early effectors，E)以及雖然在前期誘導(dǎo)表達(dá)但是表達(dá)量和上調(diào)量都相對(duì)較低(Early-weak)三種表達(dá)模式。利用Real-time PCR對(duì)親和互作中的效應(yīng)分子表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在不同菌株中的效應(yīng)分子表達(dá)模式基本一致，推測(cè)這種表達(dá)模式是程序化的，可能與其功能實(shí)現(xiàn)有關(guān)。而利用大豆疫霉轉(zhuǎn)化技術(shù)干擾兩類(lèi)表達(dá)

6、量較高的效應(yīng)分子中的關(guān)鍵基因Ayh238和Ayh172的轉(zhuǎn)錄水平，破壞其轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式，則導(dǎo)致菌株致病力明顯下降。說(shuō)明這種程式化的轉(zhuǎn)錄模式一旦發(fā)生紊亂，就會(huì)影響菌株的毒性，同時(shí)也證明兩類(lèi)高表達(dá)的效應(yīng)分子在侵染過(guò)程中都具有重要作用。
　　 對(duì)不同表達(dá)模式的效應(yīng)分子的功能做進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)，E類(lèi)的效應(yīng)分子能夠特異性抑制PAMP觸發(fā)的植物免疫反應(yīng)，而IE類(lèi)效應(yīng)分子則特別對(duì)效應(yīng)分子觸發(fā)的PCD有活性。兩類(lèi)效應(yīng)分子分別針對(duì)植物免疫系統(tǒng)的不

7、同層面，推測(cè)可能合作抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)。本研究在煙草上成功模擬了兩類(lèi)效應(yīng)分子的合作模式：卵菌的PAMP被植物的膜上受體識(shí)別激發(fā)PTI，誘導(dǎo)E類(lèi)效應(yīng)分子如Avh238在侵染前期高量上調(diào)表達(dá)，引起植物包括非寄主煙草和寄主大豆的PCD，而在侵染過(guò)程中一直表達(dá)量較高的Avh172則能夠抑制Avh238引起的PCD，而兩者的同時(shí)存在還能夠抑制INF1以及MAPK信號(hào)通路在煙草上引發(fā)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡，證明兩類(lèi)效應(yīng)分子能夠依靠功能互補(bǔ)來(lái)廣泛抑制植物的防

8、衛(wèi)反應(yīng)。
　　 本研究還發(fā)現(xiàn)Ayh238在不同菌株中的等位基因存在著高度的序列多態(tài)性。其中來(lái)自菌株P(guān)7076的Ayh238等位基因產(chǎn)物在煙草中的表達(dá)產(chǎn)物不能引起HR。功能實(shí)驗(yàn)則證明Ayh238P7076能夠抑制在煙草葉片上瞬時(shí)表達(dá)卵菌PAMP-INF1以及下游的MAPK信號(hào)通路所引起的HR反應(yīng)。證明這種序列的多態(tài)性能夠幫助RxLR效應(yīng)分子逃避植物對(duì)其的識(shí)別作用，但不會(huì)影響其本身的毒性功能。對(duì)所有已知的無(wú)毒基因和兩類(lèi)在侵染中高表達(dá)