小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)Vp1和DFR基因的等位變異、表達與調(diào)控的分子解析.pdf

1、小麥成熟期穗發(fā)芽影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì),是世界性的自然災(zāi)害,已成為我國小麥生產(chǎn)的重要限制因子之一。深入研究穗發(fā)芽抗性機理,對穗發(fā)芽抗性育種具有重要意義。本研究圍繞小麥抗穗發(fā)芽相關(guān)Vp1(Viviparous1)基因和DFR(dihydroflavonol-4-reductase)基因的等位變異、表達及調(diào)控的分子解析,開展了以下幾方面研究:(1)168份國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)普通小麥代表性品種的Vp1基因變異類型分析(2)小麥近

2、緣種中Vp1變異類型及表達特性分析,了解Vp1基因變異的起源與進化,剖析近緣種中Vp1基因的表達與小麥穗發(fā)芽抗性的關(guān)系；(3)小麥DFR基因的等位變異及表達研究,探討紅粒小麥的抗穗發(fā)芽機理；(4)Vp1啟動子在小麥中的功能分析,鑒定相關(guān)應(yīng)答元件的功能,明確啟動子的組織特異性,并探討激素應(yīng)答和調(diào)節(jié)在小麥穗發(fā)芽抗性中的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.CIMMYT小麥Vp1變異類型分析:在CIMMYT的168份代表性品種(系)中,

3、發(fā)現(xiàn)小麥3A染色體上存在5種新的Vp1Aa等位變異類型,分別命名為Vp1Ab,Vp1Ac,Vp1Ad,Vp1Ae,Vp1Af。與Vp1Aa(AJ400712)相比,這些新型變異類型的差異主要是在B3區(qū)域中內(nèi)含子中簡單串聯(lián)重復(fù)序列CTT的個數(shù)不同,其中,Vp1Ab有5個CTT的插入,Vp1Ac,Vp1Ad,Vp1Ae和Vp1Af分別有1,2,4和14個CTT的缺失,該重復(fù)序列是轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)座子的重要組成部分。另外,Vp1Af在該區(qū)域還分別

4、有2bp和6bp的缺失及5個SNP。不同等位基因類型的品種ABA敏感性試驗結(jié)果表明,Vp1Ab和Vp1Af類型具有較高ABA敏感性和穗發(fā)芽抗性。另外,本實驗還檢測出3B染色體上存在兩種Vp1B等位變異類型,一種為Vp1Bc,另一種為新發(fā)現(xiàn)類型,命名為Vp1Bg。與Vp1Ba相比,Vp1Bg在第三內(nèi)含子處具有83bp的堿基缺失,3bp的堿基插入,9bp的堿基突變及1個SNP。Vp1Bg與Vp1Bc所對應(yīng)品種的ABA敏感性并沒有明顯差異。在

5、這些材料中,Vp1Aa,Vp1Ab,Vp1Ac,Vp1Ad,Vp1Ae和Vp1Af所占比例分別為65％,10％,11％,4％,5％和5％。此外,只有13份為Vp1Bg,其余均為Vp1Bc類型。本研究為CIMMYT小麥種質(zhì)的引種和利用提供了依據(jù)。
　　 2.小麥近緣種Vp1基因的克隆與表達特性分析:在小麥近緣種中克隆并鑒定了11個新的Vp1基因等位變異類型,其中,各有3個來自于栽培一粒小麥和野生一粒小麥的Am基因組(TmVp1A1

6、,TmVp1A2,TmVp1A3分別來自栽培一粒小麥M035,M037和M043:TbVp1A1,TbVp1A2,TbVp1A3分別來自野生一粒小麥B01,B03,B05)；2個等位變異來自硬粒小麥B基因組(TduVp1B1,TduVp1B2分別來自Dr18和Dr24);另外3個等位變異來自于粗山羊草D基因組(AtVp1D1,AtVp1D2,AtVp1D3分別來自于Ae34,Ae42和Ae43)。這11個新等位變異類型與普通小麥Vp1基

7、因具有相似的結(jié)構(gòu),但在內(nèi)含子和外顯子處均有片段的插入、缺失及SNP存在。對不同等位變異類型進行半定量RT-PCR的結(jié)果表明,其表達均有選擇性剪切方式現(xiàn)象發(fā)生,且不同變異類型正常轉(zhuǎn)錄本的表達量存在差異,其中,野生一粒小麥的Am基因組TbVp1A2表達量要遠高于TbVp1A1和TbVp1A3,栽培一粒小麥Am基因組中TmVp1A2和TmVp1A3表達量高于TmVp1A1,且正確剪切轉(zhuǎn)錄本相對于非正確剪切的表達量要有所下降。硬粒小麥B基因組T

8、duVp182的表達量高于TduVp1B1。粗山羊草D基因組中AtVp1D2表達量高于AtVp1D1和AtVp1D3。對各小麥近緣種ABA敏感性的分析結(jié)果表明,具有較高表達量的等位基因的品種同樣具有較高的ABA敏感性,野生一粒小麥B03高于B01和B05,栽培一粒小麥M043高于M035和M037,硬粒小麥Dr24高于Dr18,粗山羊草.Ae34表現(xiàn)為對ABA不敏感,Ae42的ABA敏感性比Ae43高。這些結(jié)果表明,小麥近緣種中Vp1等

9、位基因及其表達特性與品種的ABA敏感性直接相關(guān),其中ABA敏感性較高的近緣屬種可做為小麥穗發(fā)芽抗性育種基因資源加以利用。
　　 3.紅粒小麥DFR基因變異與穗發(fā)芽抗性研究:在抗感穗發(fā)芽紅粒小麥品種3B染色體上發(fā)現(xiàn)了2個TaDFR-Ba的新型等位變異,分別命名為TaDFR-Bb和TaDFR-Bc。與TaDFR-Ba相比,在編碼區(qū)沒有差異,但TaDFR-Bb基因在啟動子-230bp至-237bp處有8bp的插入和在第一個內(nèi)含子處有1

10、個SNP,TaDFR-Bc則只有1個SNP。分析結(jié)果表明,表現(xiàn)為抗穗發(fā)芽的品種多數(shù)表現(xiàn)為TaDFR-Bb基因型,而表現(xiàn)為感穗發(fā)芽的品種則為其他2種基因型。根據(jù)該8bp插入設(shè)計顯性標(biāo)記DFRBb,用102份紅粒小麥材料進行驗證,結(jié)果表明,該標(biāo)記可以有效區(qū)分具有不同穗發(fā)芽抗性的紅粒小麥品種基因型,可用于紅粒小麥穗發(fā)芽抗性種質(zhì)資源的篩選和分子標(biāo)記輔助育種。不同變異類型與DFR基因表達關(guān)系正在進一步研究中。
　　 4.小麥Vp1啟動子的

11、功能分析:對已經(jīng)分離的Vp1基因上游2232bp的序列進行生物信息學(xué)預(yù)測,結(jié)果表明其含有9個脫落酸響應(yīng)元件ABRE、2個DREB和6個MYB干旱響應(yīng)元件、3個赤霉素響應(yīng)元件GARE、1個水楊酸響應(yīng)元件TCA-E、2個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG—motif、4個SKn-1和1個RYREPE胚乳特異表達元件。采用5’端缺失的方法,構(gòu)建了6個含有Vp1啟動子不同區(qū)段融合GUS報告基因的植物表達載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化四倍體小麥Stewart