PPO和PSY基因不同等位變異在山東小麥中的分布及其表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、本研究以山東385份農(nóng)家品種、90份育成品種和24份當(dāng)前主栽品種為材料，利用ppo16、ppo18、ppo29和YP7A的特異引物，檢測(cè)了ppo基因和psy基因不同等位變異在山東小麥中的分布；同時(shí)對(duì)育成品種和主栽品種的PPO活性值進(jìn)行了測(cè)定，并構(gòu)建了psy基因過(guò)量表達(dá)載體pOEPSY及ppo和psy的RNAi干涉載體pRNAiPSY和pRNAiPPO。旨在為山東小麥品質(zhì)的分子改良提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： (1)在114份

2、山東育成品種和主栽品種中，ppo基因的不同等位變異及組合類(lèi)型的頻率各不相同?；蛐蜑镻po-Ala和Ppo-Alb的品種分別為33份和81份，各占總數(shù)的28.95％和71.05％。含有Ppo-Dlα和Ppo-Dlb的品種分別為41份和73份，各占35.96％和64.04％。兩個(gè)基因組合類(lèi)型的出現(xiàn)頻率依次為：Ppo-Alb/Ppo-Dla(47.37％)>Ppo-Alb/Ppo-Dlb(23.68％)>Ppo-Ala/Ppo-Dla(16

3、.67％)>Ppo-Ala/Ppo-Dlb(12.28％)。 (2)平均PPO活性值在含有不同基因位點(diǎn)的育成品種和主栽品種中表現(xiàn)出顯著性差異?；蛐蜑镻po-Ala、Ppo-Alb、Ppo-Dla和Ppo-Dlb的育成品種和主栽品種的平均PPO活性值分別為17.58、12.31、10.97和18.70A475/min·g-1·103，Ppo-Ala和Ppo-Alb，Ppo-Dla和Ppo-Dlb之間的差異均達(dá)顯著水平(P<0.0

4、5)。組合類(lèi)型Ppo-Ala/Ppo-Dla、Ppo-Ala/Ppo-Dlb、Ppo-Alb/Ppo-Dla和Ppo-Alb/Ppo-Dlb品種的平均PPO活性值分別為13.89、21.91、9.45和17.04A475/min·g-1·103，彼此差異顯著(<0.05)。 (3)psy不同等位變異在農(nóng)家品種、育成品種及當(dāng)前主栽品種中具有不同的分布特點(diǎn)：385份農(nóng)家品種全部為野生基因型(Psy-Ala)，野生基因型在育成品種中占

5、83.33％，當(dāng)前主栽品種中，野生基因型所占比例與育成品種相同，也為83.33％。 (4)構(gòu)建完成psy基因的超表達(dá)載體pOEPSY以及psy、ppo基因的RNA干涉載體pRNAiPSY和pRNAiPPO。含有胚乳特異性啟動(dòng)子Bx17、Kana表達(dá)盒的pZLBx17作為載體構(gòu)建的基礎(chǔ)質(zhì)粒。利用兩端分別添加KpnI和BamHI酶切接頭的psy基因特異性引物擴(kuò)增其cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)KpnI和BamHI雙酶切與經(jīng)過(guò)同樣酶切的pZLB

6、x17進(jìn)行連接，構(gòu)建完成psy基因的過(guò)量表達(dá)載體pOEPSY；在基礎(chǔ)質(zhì)粒pZLBx17的KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)間插入的psy基因第四內(nèi)含子，構(gòu)建完成了具有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA干涉中間載體pZLBxIN；以ppo基因第二外顯子1112-1565bp的序列、psy基因第一外顯子222-681bp的序列，作為構(gòu)建ppo和psy基因的目標(biāo)序列，將擴(kuò)增片段通過(guò)添加不同的酶切接頭，正反向插入到pZLBxIN內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建完成RNA干涉載體