法尼基焦磷酸合成酶在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥厚中研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：抑制法尼基焦磷酸合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥厚
　　 研究背景：
　　 心肌肥厚作為一種常見疾病，可被許多體液因子如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)。各種細胞通路參與了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚，其中包括RhoA/ROCK通路。
　　 以往研究發(fā)現(xiàn)阿倫磷酸鈉(alendronate)重要機制主要是通過抑制甲羥戊酸途徑中的一種關(guān)鍵酶-法尼基焦磷酸

2、合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)，從而抑制類異戊烯化包括了法尼基化和牻牛兒牻?；鶅夯M而減少類異戊二烯化產(chǎn)物的產(chǎn)生包括法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate, FPP)和牻牛兒牻牛兒焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate, GGPP)。而GGPP對于RhoA的牻牛兒牻牛兒焦磷酸化和活化非常重要。
　　 目的：
　　 本研究主要探

3、索alendronate抑制FPPS可否影響AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚，同時研究該作用是否與RhoA/ROCK通路相關(guān)。
　　 方法：
　　 (1)加入3～30uM alendronate先孵育30min然后加入AngⅡ(1μM)共同作用48h，加藥前細胞在無血清培養(yǎng)基DMEM中孵育24h。檢測肥厚指標(biāo)包括細胞面積，細胞蛋白合成和基因BNP mRNA水平改變等。
　　 (2)在心肌細胞中加入30μM alendron

4、ate及相同濃度的GGOH先孵育30min，然后與AngⅡ(1μM)共同孵育48h，加藥前細胞在無血清培養(yǎng)基DMEM中孵育24h。檢測肥厚指標(biāo)包括細胞面積，細胞蛋白合成和基因BNP mRNA水平改變。
　　 (3)在心肌細胞中加入alendronate,RhoA/ROCK通路抑制劑包括牻牛兒牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GGTI-286, Rho的抑制劑C3 exoenzyme或ROCK的抑制劑Y-27632先孵育30min，然后與Ang

5、Ⅱ(1μM)共同孵育48 h，加藥前細胞在無血清培養(yǎng)基DMEM中孵育24 h。檢測肥厚指標(biāo)包括細胞面積，細胞蛋白合成和基因BNP mRNA水平改變。
　　 (4)在心肌細胞中加入30μM alendronate及相同濃度的GGOH或加入GGTI-286孵育48 h，然后加入AngⅡ(1μM)共同孵育15 min，用商業(yè)化pull down試劑盒和western- blot技術(shù)檢測了RhoA活性和RhoA總量的改變。
　　

6、 結(jié)果：
　　 (1)Alendronate作為FPPS抑制劑可劑量依賴性抑制AngⅡ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細胞面積增大，細胞蛋白合成量的增加及基因BNP表達的上調(diào)。
　　 (2)同濃度GGOH部分逆轉(zhuǎn)了30μM alendronate的抗心肌肥厚反應(yīng)。
　　 (3)Rho/ROCK通路抑制劑GGTI-286,C3 exoenzyme以及Y-27632可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚反應(yīng)。
　　 (4)30μM

7、alendronate抑制了AngⅡ誘導(dǎo)增加的RhoA活性，該作用可被相同濃度GGOH部分逆轉(zhuǎn)。牻牛兒牻牛兒基化過程抑制劑GGTI-286也抑制了AngⅡ?qū)hoA激活。
　　 結(jié)論：
　　 本研究實驗結(jié)果表明alendronate通過抑制FPPS可以有效逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥厚反應(yīng)，這種作用與抑制RhoA的牻牛兒牻牛兒化過程從而降低RhoA的活性相關(guān)。
　　 第二部分：RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸合成酶基

8、因改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥厚
　　 研究背景：
　　 第一部分實驗結(jié)果表明抑制法尼基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase, FPPS)可以逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚發(fā)生，提示FPPS作為AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥厚發(fā)生的重要治療靶點。
　　 我們實驗組前期高通量RNA陣列技術(shù)(RNA array)結(jié)果表明FPPS的mRNA水平在18周

9、自發(fā)高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)肥厚心臟組織比同周齡WKY大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)高。而18周SHR的心肌肥厚與其局部RAS系統(tǒng)激活A(yù)ngⅡ含量升高相關(guān)。
　　 上述所有證據(jù)都表明FPPS在AngⅡ介導(dǎo)心肌肥厚中可能的重要性。
　　 目的：
　　 本實驗探究了FPPS水平是否在AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥厚模型有所改變，同時在此基礎(chǔ)上研

10、究通過RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)PPS基因的表達，觀察是否影響到心肌肥厚的發(fā)生，并進一步研究FPPS下游主要細胞通路的改變。
　　 方法：
　　 (1)使用real-time PCR和western-blot技術(shù)檢測AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥厚模型中FPPS的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。
　　 (2)設(shè)計并構(gòu)建針對四個不同靶序列FPPS干擾質(zhì)粒載體PGC-sh-FPPS和帶有綠色熒光蛋白的FPPS融合蛋白質(zhì)粒(FPPS-GFP)。通過外

11、源表達系統(tǒng)在HEK-293T細胞共表達，以免疫熒光和western-blot檢測GFP表達判斷最有效靶序列。
　　 (3)選擇最有效靶序列構(gòu)建和擴增FPPS干擾重組慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞觀察FPPS的下調(diào)是否影響β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)和B-型腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)基因及細胞表面積的改變。慢病毒顆粒注射7周SHR大鼠心肌，11周

12、后稱重并進行心臟超聲學(xué)檢查。心臟稱重獲得心臟重/體重比(heart weight/body weight, HW/BW)和左室重/體重比(left ventricularweight/body weight, LVW/BW)，并檢測左室β-MHC和BNP的改變。
　　 (4)在細胞水平進一步研究FPPS基因沉默后下游主要通路的改變。使用pulldown試劑盒和western-blot方法檢測RhoA的活性和表達量改變，用細胞免疫

13、熒光激光共聚焦技術(shù)檢測RhoA的定位，用western-blot檢測JNK和P38 MAPK(mitogenactivated protein kinases)的活性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)AngⅡ(1μM)在誘導(dǎo)心肌細胞肥厚同時上調(diào)了FPPS的水平，18周齡SHR肥厚心臟中FPPS的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也上調(diào)。
　　 (2)成功構(gòu)建FPPS干擾重組慢病毒載體沉默F(xiàn)PPS水平的同時可以明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細

14、胞表面積及β-MHC和BNP的mRNA水平?；铙w實驗表明FPPS下調(diào)的同時，肥厚指標(biāo)包括HW/BW和LVW/BW的減少，肥厚標(biāo)記基因β-MHC和BNP水平的下調(diào)。心超結(jié)果顯示SHR干擾組舒張期室間隔壁厚度(interventricular septum wall thickness at diastolic phase, IVSd)部分逆轉(zhuǎn)，同時左室短軸縮短率(fracTiO2 shortening,FS)和射血分?jǐn)?shù)(ejecTiO2

15、fracTiO2,EF)均有部分改善。
　　 (3)FPPS基因干擾有效抑制了心肌細胞中AngⅡ誘導(dǎo)的RhoA活性和易位，并逆轉(zhuǎn)了AngⅡ激活的P-38和JNKMAPK通路。
　　 結(jié)論：
　　 FPPS水平在AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥厚上調(diào)，提示FPPS在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥厚中的重要性。同時FPPS調(diào)控的RhoA/P-38/JNK MAPK在AngⅡ介導(dǎo)的心肌肥厚中扮演著重要作用。
　　 第三部分：阿倫磷酸鈉

16、對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細胞的增殖分化和膠原形成的影響
　　 研究背景：
　　 含氮類雙磷酸鹽(N-BPs)廣泛用于骨骼相關(guān)性疾病和腫瘤中。第一部分研究發(fā)現(xiàn)阿倫磷酸鈉(alendronate),一種權(quán)威的N-BPs能有效逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚反應(yīng)。以往研究也報道alendronate可以有效抑制自發(fā)性高血壓大鼠的心肌肥厚及心肌纖維化。
　　 目的：
　　 本實驗為進一步觀察alendron

17、ate是否可以調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的新生鼠心肌成纖維細胞的增殖、分化及膠原生成。
　　 方法：
　　 予以新生wistar鼠心肌成纖維細胞原代培養(yǎng)，傳代第二到四代予以使用。細胞增殖用細胞數(shù)目試劑盒進行檢測。利用免疫印跡方法檢測成纖維細胞的分化標(biāo)志物α-肌動蛋白的表達。膠原合成采用實時定量PCR技術(shù)檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原前體的mRNA水平，同時使用商業(yè)化試劑盒檢測膠原蛋白羥脯氨酸的合成。另外轉(zhuǎn)錄生長因子-βi的含量和和P38促細胞

18、分裂劑激活性蛋白激酶激酶的活性分別用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和免疫印跡技術(shù)進行檢測。
　　 結(jié)果：
　　 Alendronate可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細胞的增殖分化及隨后的膠原的形成。同時TGF-βi蛋白的表達和分泌及P38 MAPK的活性都得以被alendronate逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究提示alendronate對AngⅡ誘導(dǎo)的細胞增殖，細胞分化及膠原形成可有效抑制。這種作用可能與TGF-β