一-法尼基焦磷酸合成酶的抑制改善去甲腎上腺素誘導的高血壓大鼠血管平滑肌細胞纖維化二-急性心肌梗死時外周血中升高的S100A8-A9不是來源于心肌細胞.pdf

1、第一部分
　　 研究背景:
　　 血管纖維化是高血壓病的一個重要特征。去甲腎上腺素(NE)及結(jié)締組織生長因子(CTGF)參與了高血壓過程中的血管纖維化。法尼基焦磷酸合成酶(famesylpyrophosphate synthase,FPPS)是甲羥戊酸途徑中的一個關(guān)鍵酶,催化合成類異戊二烯化產(chǎn)物的產(chǎn)生包括法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)和攏牛兒櫳牛兒焦磷酸(geranylgeranylp

2、yrophosphate,GGPP)。含氮雙膦酸鹽如阿侖膦酸鈉、伊班膦酸鈉作為異戊二烯雙膦酸脂類類似物特異性地抑制FPPS活性。FPPS在高血壓大鼠心肌和血管組織中表達升高,抑制FPPS活性能改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚及纖維化。
　　 目的:本研究主要探索FPPS是否參與了高血壓過程中NE介導的血管纖維化,并探討其可能機制。
　　 方法:
　　 1)用膠原酶法從10～12周齡WKY、SHR大鼠胸主動脈獲得平滑肌

3、細胞(VSMCs)。細胞免疫熒光鑒定細胞。
　　 2)VSMCs同步化后加入FPPS抑制劑-伊班膦酸鈉(0、5、10μM)或NE(0.01、0.1、1、10μM)共同作用24h,采用CCK-8、Annexin V-FITC檢測伊班膦酸鈉對VSMCs增殖、凋亡的影響；用Western blot、實時定量PCR檢測CTGF、FPPS及Ⅰ型膠原蛋白前體(α-1 procollagenⅠ)表達；羥脯氨酸檢測試劑盒測定培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量

4、。
　　 3)VSMCs同步化后加入5、10μM伊班膦酸鈉先孵育2h,然后加入NE(0.01、0.1、1、10μM)共同作用24h,用Western blot檢測CTGF表達的變化,羥脯氨酸檢測試劑盒測定培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量,CCK-8檢測細胞增殖。
　　 4)SHR-VSMCs同步化后加入10μM伊班膦酸鈉及30μM GGOH、30μM FOH或10μM GGTI-286、10μM FTI-276先孵育2h,然后與NE

5、(0.1μM)共同孵育24h,用Western blot檢測CTGF表達的變化。
　　 5)SHR-VSMCs同步化后加入10μM伊班膦酸鈉先孵育24h,然后與NE(0.1μM)共同孵育30 min,用pull down試劑盒和western—blot技術(shù)檢測Ras活性和Ras總量的變化。
　　 6)SHR-VSMCs同步化后加入10μM伊班膦酸鈉先孵育24h,然后與NE(0.1μM)共同孵育5 min,用Western

6、 blot檢測extracellular signal-regulated kinase(ERK1／2),stress-activated protein kinase／c-Jun N-terminal kinase(JNK)和p38磷酸化水平。
　　 7)SHR-VSMCs同步化后加入10μM伊班膦酸鈉,PD98059(ERK1／2 inhibitor,50μM),SB-203580(p38 MAPK inhibitor,10

7、μM)及SP600125(JNK-1,-2,-3inhibitor,10μM)先孵育2h,然后與NE(0.1μM)共同孵育24h,用Western blot檢測CTGF表達的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1)倒置相差顯微鏡觀察及細胞免疫熒光證明培養(yǎng)的細胞是平滑肌細胞。
　　 2)基礎(chǔ)狀態(tài)下,SHR-VSMCs增殖、CTGF蛋白及mRNA表達、α-1 procollagenⅠmRNA表達、羥脯氨酸分泌、FPPS蛋白及

8、mRNA表達均高于WKY-VSMCs。NE0.01、0.1、1、10μM作用24h,劑量依賴性增加VSMCs增殖、CTGF表達、FPPS表達、α-1 procollagenⅠ表達、羥脯氨酸分泌。與接受相同劑量NE處理的WKY-VSMCs相比,SHR—VSMCs對NE的反應明顯增強。
　　 3)伊班膦酸鈉作為FPPS抑制劑可劑量依賴性抑制NE0.1 gM誘導的SHR-VSMCs增殖,CTGF蛋白表達,羥脯氨酸分泌。伊班膦酸鈉單獨孵

9、育24h不影響WKY-VSMCs及SHR-VSMCs增殖、CTGF蛋白表達和羥脯氨酸分泌。
　　 4)FOH部分逆轉(zhuǎn)了10μM伊班膦酸鈉的抗血管纖維化作用,FTI-276模擬了伊班膦酸鈉的抗纖維化作用。
　　 5)NE0.1μM30min升高SHR-VSMCs Ras活性,10μM伊班膦酸鈉預處理24h能下調(diào)NE升高的Ras活性。
　　 6)NE0.1μM5min升高SHR—VSMCs ERK1／2、p38和JN

10、K磷酸化水平,10μM伊班膦酸鈉預處理24h能下調(diào)三者磷酸化水平。
　　 7)p38MAPK抑制劑SB203580可抑制NE0.1μM誘導的SHR—VSMCs CTGF蛋白表達。
　　 結(jié)論:
　　 1)NE誘導VSMCs增殖、纖維化反應。與WKY-VSMCs相比,SHR-VSMCs對NE的反應明顯增強。
　　 2)NE誘導VSMCs FPPS表達。與WKY-VSMCs相比,SHR-VSMCs對NE的反應

11、明顯增強。
　　 3)抑制FPPS活性可以有效逆轉(zhuǎn)NE誘導的血管纖維化反應,這種作用與抑制Ras活化及p38MAPK磷酸化相關(guān)。
　　 背景:S100A8／A9被廣泛地研究并被認為是多種急慢性炎癥疾病炎癥活動的生物指標。急性心肌梗死(AMI)病人外周血中S100A8／A9急劇升高,參與了冠狀動脈粥樣硬化性疾病及其并發(fā)癥的病理過程。然而,急性心肌缺血損傷本身能否誘導S100A8和S100A9在心肌細胞內(nèi)表達,甚至心肌細胞是

12、否為AMI時外周血升高的S100A8／A9的細胞來源一直未被研究過。
　　 第二部分
　　 目的:本研究利用大鼠離體心臟灌流全心缺血模型及心肌細胞缺血缺氧模型來探索急性心肌缺血損傷能否誘導S100A8和S100A9在心肌細胞內(nèi)表達,以明確心肌細胞是否為AMI時外周血升高的S100A8／A9的細胞來源。
　　 方法:離體16周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常血壓大鼠(WKY)心臟在Langendorff灌流裝

13、置上給予不同處理:對照組,改良Kreb's Henseleit(K-H)液持續(xù)灌流60分鐘:缺血30分鐘組；缺血60分鐘組。此外,通過左冠狀動脈結(jié)扎方法建立在體AMI模型。乳鼠心肌細胞培養(yǎng)后給予不同時間(0、120、240分鐘)缺血缺氧處理。實時熒光定IPCR(qRT-PCR)檢測心肌組織S100A8和S100A9 mRNA表達。免疫印跡方法檢測心肌組織和心肌細胞中NF-kappa B p65、S100AS和S100A9的蛋白表達。