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文檔簡介
1、該研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在著心肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)控因素,這些信號(hào)分子通過與促心肌細(xì)胞肥大因子的相互作用,維持著細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能與基因表達(dá)狀態(tài)的平衡。磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN可能參與了對(duì)心肌肥大的負(fù)性調(diào)節(jié)。異丙腎上腺素能夠增加心肌內(nèi)PTEN表達(dá);心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN的過度表達(dá)能明顯抑制IGF-1誘導(dǎo)的心肌肥大,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡;PTEN可通過與不同亞型的PI3K相互作用,PTEN/PI3Kα信號(hào)通路能抑制心肌肥厚,PTEN/PI3Kγ
2、調(diào)節(jié)心臟功能。以上研究結(jié)果提示在心肌肥大過程中,刺激因素引起心肌肥大信號(hào)通路激活的同時(shí),也激活了PTEN參與的負(fù)性調(diào)控通路。 本實(shí)驗(yàn)探討PTEN過度表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ刺激所致的適應(yīng)不良性心肌細(xì)胞肥大的影響,以期進(jìn)一步了解PTEN在心肌肥大中的作用及其機(jī)制。 研究方法: 1.通過定向克隆和基因重組構(gòu)建攜帶野生型PTEN基因的腺病毒載體(Ad-PTEN),同時(shí)構(gòu)建攜帶G129E(喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性,僅保留蛋白磷酸酶
3、活性的PTEN突變體)基因的腺病毒載體(Ad-G129E)。 2.通過病毒感染構(gòu)建過度表達(dá)PTEN或G129E的原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型,通過追蹤綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá),檢測(cè)不同感染倍數(shù)(M.O.I.)的感染效率,以及感染后24h,48h和72h時(shí)GFP表達(dá)陽性率;結(jié)合MTT法觀察受感染心肌細(xì)胞活力,確定合適的感染倍數(shù)和病毒表達(dá)時(shí)間。 3.用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)受感染細(xì)胞內(nèi)PTEN或G129E的mR
4、NA和蛋白表達(dá),檢測(cè)通過腺病毒感染介導(dǎo)能否有效地引起心肌細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN或G129E。 4.用AngⅡ作為促心肌肥大刺激劑,觀察PTEN或G129E過度表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響,ANF、β-NHC和細(xì)胞直徑作為肥大指標(biāo),僅攜帶GFP的空病毒(Ad-GFP)作為對(duì)照。 5.Furo-2/AM比率熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CaNAβ的mRNA,WesternBlot檢測(cè)
5、CaNAβ、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellularsignal-regulatedkinase1/2;ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的蛋白表達(dá),同時(shí)測(cè)定CaN磷酸酶活性。 結(jié)果: 1.通過同源重組,在AD293包裝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了具有感染能力的腺病毒顆粒;通過反復(fù)感染過程,獲得較高滴度腺病毒液。 2.Ad-PTEN,Ad-G129E和Ad-GFP感染心肌細(xì)胞后,GFP表達(dá)陽性率隨著
6、M.O.I.和時(shí)間增加而增加;M.O.I.達(dá)到100以上時(shí),細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到90%以上;各種M.O.I.感染48h后,GFP陽性表達(dá)趨于穩(wěn)定,因此確定感染后48h作為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的適宜表達(dá)時(shí)間。 3.MTT結(jié)果顯示,病毒感染后48h,隨著M.O.I.的增加,細(xì)胞活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(Ad-GFP:β=-0.217,p>0.05;Ad-PTEN:β=-0.470,p<0.05;Ad-G129E:β=-0.372,p<0.05)。M
7、.O.I.超過100后細(xì)胞活力明顯下降;因此采用M.O.I.100,感染后48h作為下一步實(shí)驗(yàn)的條件。 4.RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)顯示,攜帶外源基因PTEN或G129E的腺病毒感染后,心肌細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN或G129E的mRNA和蛋白。 5.AngⅡ刺激能夠引起心肌細(xì)胞肥大,伴有肥大標(biāo)志基因ANF、β-MHC表達(dá)顯著增高;而PTEN的過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ刺激所致的心肌細(xì)胞肥大和胚胎型基因表達(dá)
8、;G129E過度表達(dá)與PTEN過度表達(dá)相比,肥大抑制作用明顯降低。 6.AngⅡ刺激使[Ca2+]i明顯增高,PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的[Ca2+]i增高,G129E過度表達(dá)心肌細(xì)胞[Ca2+]i顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 7.AngⅡ刺激使CaNAβmRNA與蛋白表達(dá)明顯增高,PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的CaNAβmRNA與蛋白表達(dá),G129E過度表達(dá)的心肌細(xì)胞內(nèi)CaNAβmRN
9、A與蛋白表達(dá)顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 8.AngⅡ刺激使CaN磷酸酶活性明顯增高,PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的CaN磷酸酶活性增高,G129E過度表達(dá)的心肌細(xì)胞內(nèi)CaN磷酸酶活性顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 9.AngⅡ刺激使ERK1/2與pERK1/2蛋白表達(dá)明顯增高,PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的ERK1/2與pERK1/2蛋白表達(dá),G129E過度表達(dá)的心肌細(xì)胞內(nèi)ERK1
10、/2與pERK1/2蛋白水平顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 結(jié)論: 通過腺病毒介導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng),而G129E過度表達(dá)則對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制能力明顯降低,提示PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性參與了對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大的負(fù)性調(diào)控過程;同時(shí),PTEN對(duì)AngⅡ激活的Ca2+/CaN/NFAT3和MEK1/ERK1/2信號(hào)通路表現(xiàn)出明顯的抑制作用,這些信號(hào)通路可能參與
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