血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大經(jīng)典瞬時(shí)電位通道的表達(dá)改變及其對(duì)缺氧昨氧損傷的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察血管緊張素(Angiotensin，Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞經(jīng)典瞬時(shí)受體電位(Canonical Transient Receptor Potential，TRPC)通道表達(dá)變化以及其對(duì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響。探討經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道表達(dá)的分子機(jī)制和其在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)凋亡中的作用。
　　 方法：
　　 1.分離、培養(yǎng)健康新生Spraque-Dawley大鼠(2-5日齡)的心肌細(xì)胞
　　

2、 2.終濃度為0.1μ M血管緊張素Ⅱ刺激前述細(xì)胞48小時(shí)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
　　 3.心肌肥大的鑒定：用BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，[3H]-亮氨酸摻入法檢測(cè)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率，應(yīng)用Motic Images1.3軟件測(cè)量心肌細(xì)胞的表面積。
　　 4.實(shí)驗(yàn)分成7組：它們是對(duì)照組，AngⅡ組，SKF96365+AngⅡ組，Losartan+AngⅡ組，PD123319+AngⅡ組，U73122+AngⅡ組及CsA+An

3、gⅡ組。
　　 5.樣本進(jìn)行細(xì)胞缺氧(5％CO2+95％N2)6小時(shí)，然后復(fù)氧(5％CO2+21％O2)4小時(shí)培養(yǎng)來模擬心肌的缺血再灌注。
　　 6.采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞經(jīng)典瞬耐受體電位通道TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6和TRPC7 mRNA的表達(dá)。
　　 7.采用蛋白雜交印跡技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道TRPC1、TRPC3和TRPC6以及肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋

4、白α-fodrin的表達(dá)。
　　 8.采用Annexin V FITC/PI雙染色進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)和Hoechst33258染色技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1.終濃度為0.1μ M血管緊張素Ⅱ成功誘導(dǎo)出肥大心肌細(xì)胞。與對(duì)照組相比，血管緊張素Ⅱ刺激心肌細(xì)胞48h后，[3H]-亮氨酸摻入明顯增加，(分別為2103±203 CPM/孔，n=6；1239±154 CPM/孔，n=6；p<0.05)。血管緊張

5、素Ⅱ組的蛋白濃度高于空白對(duì)照組(分別為1503±146μg/well，n=6；1075±118μ g/well，n=6；p<0.05)。MoticImages1.3軟件測(cè)量發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ組細(xì)胞的表面積增加1.46倍。
　　 2.血管緊張素Ⅱ刺激心肌細(xì)胞48小時(shí)后，定量RT-PCR檢測(cè)TPRC的mRNA發(fā)現(xiàn)：TRPC1和TRPC3的mRNA表達(dá)上調(diào)，mRNA的量分別是空白對(duì)照組的1.45倍和1.24倍(p<0.05，n=4)；T

6、RPC6的mRNA未發(fā)現(xiàn)有明顯變化，(p>0.05，n=4)；而TRPC2、TRPC4、TRPC5以及TRPC7的mRNA低于對(duì)照組(p<0.05。n=4)。
　　 3.運(yùn)用蛋白雜交印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ組TRPC1對(duì)GAPDH的相對(duì)密度比要高于對(duì)照組，而在AngⅡ組中TRPC3與TRPC6對(duì)GAPDH的相對(duì)密度比無明顯變化。表明血管緊張素Ⅱ在蛋白水平上調(diào)TRPC1表達(dá)，但未影響TRPC3和TRPC6表達(dá)。
　　 4.

7、加入血管緊張素Ⅱ前，分別先加入AT1受體阻滯劑Losartan、AT2受體阻滯劑PD123319、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)抑制劑U73122、TRPC通道阻滯劑SKF96365和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A(Cyclosporin A，CsA)。蛋白雜交印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Losartan+AngⅡ組的TRPC1低于AngⅡ組與對(duì)照組，這在U73122+AngⅡ組，SKF96365+AngⅡ組和CsA+AngⅡ組

8、也呈現(xiàn)同樣的結(jié)果。但PD123319+AngⅡ組是個(gè)例外。這表明Losartan，U73122，SKF96365和CsA都能抑制血管緊張素Ⅱ刺激的心肌細(xì)胞TRPC1的高表達(dá)。而AT2受體阻滯劑PD123319對(duì)血管緊張素Ⅱ刺激的TRPC1高表達(dá)無明顯影響。
　　 5.[3H]-亮氨酸摻入法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SKF96365+AngⅡ組的放射性強(qiáng)度(1452±172CPM/well)小于AngⅡ組放射性強(qiáng)度(2103±203 CPM/we

9、ll)(n=6；p<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SKF96365+AngⅡ組的細(xì)胞表面積小于AngⅡ組，是空白對(duì)照組的1.29倍，而AngⅡ組的細(xì)胞表面積是對(duì)照組的1.46倍，兩者相比有明顯差異(p<0.05)。表明SKF96365能部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 6.心肌細(xì)胞缺氧6小時(shí)后再復(fù)氧4小時(shí)進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷檢測(cè)。(1)對(duì)照組，AngⅡ組與SKF96365+AngⅡ組的乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogen

10、ase，LDH)值和壞死率無顯著差異(p>0.05)。(2)Annexin V FITC/PI雙染色檢測(cè)和Hoechst33258染色檢測(cè)凋亡率，發(fā)現(xiàn)在AngⅡ組中凋亡率最高，SKF96365+AngⅡ組的凋亡率低于AngⅡ組。這表明SKF96365能降低凋亡率。(3)剪切α-fodrin蛋白與完整α-fodrin蛋白的比值在SKF96365+AngⅡ組高于對(duì)照組而低于AngⅡ組。
　　 結(jié)論
　　 1.體外培養(yǎng)新生大鼠

11、心肌細(xì)胞時(shí)，0.1μ M濃度的血管緊張素Ⅱ可安全成功地誘導(dǎo)出心肌細(xì)胞肥大。
　　 2.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中，其TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)；阻滯TRPC可以部分抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大，TRPC1在心肌肥大過程中發(fā)揮十分重要的作用。
　　 3.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)TRPC1通道高表達(dá)的機(jī)制可能為：結(jié)合AT1受體-PLC-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子這一途徑來上調(diào)TRPC1表達(dá)，并通過TRPC1自身