磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN抑制TGFβ1刺激的大鼠腎成纖維細(xì)胞增殖及ColⅣ、FN分泌.pdf

1、背景與目的： 腎組織纖維化是所有慢性腎臟疾病導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要病理機(jī)制。迄今仍無(wú)有效阻止腎組織纖維化發(fā)生發(fā)展的確切方法?，F(xiàn)有的研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)在腎組織的過(guò)度沉積是引起腎組織纖維化的主要原因，而腎成纖維細(xì)胞是腎組織中產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞。因此，能否阻止腎組織纖維化進(jìn)程關(guān)鍵在于能否阻斷腎成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和分泌。 染色體10上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(P

2、hosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10，PTEN)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑制基因。PTEN蛋白具有脂性磷酸酯酶活性和蛋白性磷酸酯酶活性，可以抑制磷酯酰肌醇三磷酸激酶(Phosphatidylinosito1-3-kinase，PI3K)信號(hào)傳導(dǎo)通路并參與負(fù)性調(diào)控絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路。已有的研究表明P

3、I3K和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控等一系列過(guò)程，在腎組織纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此PTEN有可能在腎組織纖維化過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforminggrowthfactor-beta，TGFβ1)刺激體外培養(yǎng)的大鼠腎成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)PTEN的變化，以及PTEN蛋白對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞增殖和分泌Ⅳ型膠原(Collage

4、nⅣ，ColⅣ)、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)的影響，探討PTEN蛋白在腎組織纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，為腎組織纖維化的防治提供新的思路。 方法： 1.分離、純化、培養(yǎng)大鼠腎成纖維細(xì)胞，并用光電鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2.轉(zhuǎn)染攜帶PTEN基因的腺病毒及僅帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)基因的空病毒載體，通過(guò)檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞比率了解轉(zhuǎn)染效率，并結(jié)合四甲基

5、偶氮唑法(Metromethylthiazolylblue，MTT)測(cè)定細(xì)胞活力確定最佳轉(zhuǎn)染倍數(shù)及最佳轉(zhuǎn)染后表達(dá)時(shí)間。利用RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)入的PTEN基因是否有效表達(dá)。 3.TGFβ1刺激培養(yǎng)的大鼠腎成纖維細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)TGFβ1刺激后PTENmRNA和蛋白表達(dá)的變化；通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen

6、，PCNA)表達(dá)，以了解PTEN基因編碼蛋白對(duì)TGFβ1刺激所致成纖維細(xì)胞增殖的影響；通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)ColⅣ、FN含量，以了解PTEN基因編碼蛋白對(duì)TGFβ1刺激所致細(xì)胞分泌ColⅣ、FN的影響。 結(jié)果： 1.通過(guò)改進(jìn)細(xì)胞消化方法，成功分離培養(yǎng)了大鼠腎成纖維細(xì)胞，為后續(xù)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)保證。 2.攜帶PTEN基因的腺病毒及僅

7、帶GFP基因的空病毒載體轉(zhuǎn)染腎成纖維細(xì)胞后24、36、48h，隨著感染倍數(shù)(Multiplicityofinfection，MOI)增高，轉(zhuǎn)染效率增加。轉(zhuǎn)染后36h所有MOI的細(xì)胞熒光明顯增多、增強(qiáng)，其中PTEN組、GFP組MOI=200的GFP陽(yáng)性細(xì)胞比率分別達(dá)86.7％、84.7％，且細(xì)胞活力無(wú)顯著下降，轉(zhuǎn)染后48h所有MOI的GFP陽(yáng)性細(xì)胞比率與轉(zhuǎn)染后36h相比無(wú)明顯差異。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用MOI=200轉(zhuǎn)染36h。 3.

8、正常大鼠腎成纖維細(xì)胞可以表達(dá)PTENmRNA和蛋白，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示PTEN蛋白在胞漿、胞核均有表達(dá)。RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示攜帶PTEN基因的腺病毒轉(zhuǎn)染腎成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞能有效表達(dá)PTENmRNA和蛋白，其表達(dá)量較空白對(duì)照組及GFP空病毒組明顯增加(P＜0.05)。 4.給予TGFβ1刺激后，腎成纖維細(xì)胞表達(dá)PTENmRNA和蛋白量較空白對(duì)照組明顯減少(P＜0.05)。 5.給予TGFβ1刺激后，腎成纖

9、維細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，PTEN蛋白大量表達(dá)能抑制TGFβ1刺激所致細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為MTT檢測(cè)細(xì)胞活力顯著下降(P＜0.01)和PCNA蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。 6.ELISA結(jié)果顯示，給予TGFβ1刺激后，腎成纖維細(xì)胞分泌ColⅣ、FN明顯增多，PTEN蛋白大量表達(dá)能明顯抑制TGFβ1刺激所致ColⅣ、FN的分泌(P＜0.05)。 結(jié)論： 正常大鼠腎成纖維細(xì)胞可以表達(dá)PTENmRNA和蛋白，TGFβ1