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文檔簡介
1、目的:
該實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6J背景的野生型(wild-type,WT)小鼠和白介素-12p35基因敲除(interleukin-12p35knockout,IL-12p35-KO)小鼠復(fù)制血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)所致的高血壓心肌肥厚模型,研究心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展過程中IL-12p35的表達(dá)情況,探討IL-12p35基因缺失對心肌肥厚過程中的炎癥和自噬調(diào)節(jié)作用,為臨床治療高血壓所致心肌肥厚提供新的治療
2、靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1.實(shí)驗(yàn)分組:10-12周雄性野生型C57BL/6J16只,隨機(jī)分成2組,每組8只,A組:陰性對照組,B組:陽性對照組;10-12周IL-12p35-KO雄性小鼠(C57BL/6J背景)16只,隨機(jī)分成2組,每組8只,C組:實(shí)驗(yàn)組D組:條件對照組。
2.血壓監(jiān)測:使用小動物血壓測量儀(BP-98A,Softron,Japan)進(jìn)行尾動脈測量血壓和心率。
3.心臟超聲:使用
3、小動物超聲儀(Visual Sonics Vevo2100)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
4.心肌肥厚的檢測:Real-time PCR檢測心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)的表達(dá)。
5.心肌體重指數(shù):心肌質(zhì)量/體重(Heart weight/Body weight,HW/BW)觀察心肌
4、肥厚情況。
6.心肌纖維化:使用Masson三色特殊染色法檢測心肌組織纖維化程度。
7.心肌炎癥浸潤:使用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察炎癥的浸潤情況,免疫組織化學(xué)染色法檢測CD3、CD68的表達(dá)。
8.自噬的檢測:使用蛋白免疫印記(Western Blot,WB)和免疫組化化學(xué)染色檢測微管相關(guān)蛋白-1輕鏈3(Microtubule-associated prote
5、in1light chain3,LC3)、p62的表達(dá)。
9.心肌肥厚IL-12p35的表達(dá):Real-time PCR檢測IL-12p35。
10.信號通路:使用WB檢測JAK2/STAT4(signal transducers and activators of transcription)通道磷酸化情況,進(jìn)行下游通路機(jī)制的研究。
11.統(tǒng)計:使用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)
6、±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間的比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用one-way ANOVA,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.001為有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
結(jié)果:
在AngⅡ灌注前4組的基礎(chǔ)血壓沒有統(tǒng)計學(xué)差異,AngⅡ灌注后3天血壓開始升高,在第3周達(dá)到峰值,持續(xù)至第4周,并且心臟超聲和心肌肥厚標(biāo)志物:ANP、BNP、Collagen InRNA的檢測表明高血壓心肌肥厚建模成功,其中
7、IL-12p35-KO+AngⅡ組收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、HW/BW較WT+AngⅡ組明顯升高,并且有統(tǒng)計學(xué)意義。HE、Masson染色反映了AngⅡ微量滲透泵持續(xù)灌注的小鼠,心肌纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤明顯、心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂,肌纖維斷裂,細(xì)胞核畸形、空泡樣變較顯著,其中IL-12p35-KO+AngⅡ組較WT+AngⅡ組明顯,并且有統(tǒng)計學(xué)意義。持續(xù)的AngⅡ微量滲透泵灌注增加了CD3、CD6
8、8的表達(dá)。IL-12p35基因的缺失使自噬反應(yīng)增強(qiáng),并且促進(jìn)了JAK2/STAT4信號通路的磷酸化,而AngⅡ微量滲透泵灌注加重了自噬反應(yīng)和JAK2/STAT4信號通路的磷酸化。經(jīng)過AngⅡ微量滲透泵灌注后的小鼠,WT+AngⅡ組小鼠心肌組織中IL-12p35mRNA表達(dá)較WT組明顯升高。
結(jié)論:
通過AngⅡ微量滲透泵灌注建立了高血壓心肌肥厚小鼠模型,研究表明IL-12p35基因的缺失可以促使血壓更高,增大HW/B
9、W,加重炎癥浸潤、心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、肌纖維斷裂、細(xì)胞核畸形、空泡樣變和自噬水平,同時也可以激活JAK2/STAT4信號通路的磷酸化,并且WT+AngⅡ組小鼠心肌組織中IL-12p35mRNA表達(dá)較WT組明顯升高。說明IL-12p35基因不僅參與了AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心肌肥厚的病理過程,而且還具有抑制炎癥和調(diào)控自噬的效應(yīng),并且這些生物學(xué)效應(yīng)可能是由JAK2/STAT4信號通路介導(dǎo)的。由此可見IL-12p35可能成為防治高血壓所致心肌
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