木犀草素-7-O-葡萄糖苷對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚的作用及機(jī)制研究.pdf

1、高血壓、冠心病、心肌梗塞、糖尿病性心肌病以及瓣膜性心臟病等疾病均會(huì)引起心室重構(gòu)及心功能不全，導(dǎo)致病理性心肌肥厚的發(fā)生。病理性的心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭(Heart failure，HF)的重要因素之一，且由于其病理機(jī)制復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)防治心肌肥厚有效方法。目前的研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚時(shí)，心臟中自噬的水平會(huì)發(fā)生變化。自噬過(guò)程中會(huì)形成自噬溶酶體，將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、變形的蛋白質(zhì)以及病原體等進(jìn)行降解，提供細(xì)胞所需要的能量，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。

2、心肌細(xì)胞中自噬處于正常水平時(shí)，其能夠維持心臟結(jié)構(gòu)和功能，但自噬被過(guò)度激活時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)內(nèi)主要活性物質(zhì)，AngⅡ水平的升高導(dǎo)致機(jī)體心肌肥厚。大量的研究表明，自噬在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚中有著重要的作用，但對(duì)于自噬在AngⅡ誘導(dǎo)的肥厚中的作用及機(jī)制尚未有定論。對(duì)于自噬通路的研究，將有利于從自噬的角度探討AngⅡ誘導(dǎo)的心臟肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及機(jī)制，明確心肌細(xì)胞自噬

3、與心肌肥厚的關(guān)系以及對(duì)心肌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)，將為研發(fā)新的治療或預(yù)防心肌肥厚、繼而心衰以及心肌梗死等心臟病疾病的藥物尋找靶點(diǎn)。
　　木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-glucoside，LUTG)是一種青蘭屬植物提取的黃酮類化合物，能夠減輕心肌損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)LUTG能夠減輕抗腫瘤藥物多柔比星導(dǎo)致的心臟毒性;LUTG還能夠通過(guò)調(diào)控自噬減輕心肌饑餓損傷。但目前對(duì)于LUTG在AngⅡ?qū)е碌男募》屎袷欠裼凶饔靡约捌渚唧w

4、的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題主要通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，對(duì)LUTG在AngⅡ?qū)е碌男募》屎裰械淖饔眠M(jìn)行了研究，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，為開(kāi)發(fā)逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　體外實(shí)驗(yàn):MTT實(shí)驗(yàn)顯示，低濃度的LUTG(≤20μmol/L)時(shí)，LUTG對(duì)H9c2細(xì)胞的活力影響不大(P＞0.05);隨著LUTG濃度升高，當(dāng)LUTG濃度≥40μmol/L時(shí)會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞細(xì)胞增殖。采用AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥厚模型，細(xì)胞拍照，并用Image Pro

5、Plus軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞表面積，結(jié)果顯示20μmol/L LUTG能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌表面積的增加;采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果顯示LUTG能夠降低AngⅡ誘導(dǎo)的蛋白濃度的升高;采用Real-time PCR檢測(cè)ANP mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，LUTG能夠降低心肌細(xì)胞ANP mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果顯示，LUTG能夠改善AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　采用DCFH-DA染色和MDA試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞ROS和MDA，結(jié)果顯示LU

6、TG可減弱AngⅡ處理組ROS水平和MDA含量;采用AO染色和LTG染色發(fā)現(xiàn)，LUTG能夠抑制AngⅡ?qū)е碌淖允伤降纳?Western blotting結(jié)果顯示:LUTG能夠降低AngⅡ處理組DNA雙鏈損傷蛋白γ-H2AX的表達(dá)和Nrf2的入核，能夠降低自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)和LC3B2/LC3B1的比值，升高P62的表達(dá)，上調(diào)p-Akt、Akt、mTOR和P-mTOR的蛋白表達(dá)。以上結(jié)果顯示:LUTG可能是通過(guò)抑制ROS

7、的生成，影響Akt/mTOR通路，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。
　　另外采用LTG染色以及Western blotting考察了3-MA和LUTG合用對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌自噬水平的影響，結(jié)果顯示3-MA預(yù)處理可抑制AngⅡ誘導(dǎo)自噬水平的升高，3-MA和LUTG合用能夠協(xié)同抑制AngⅡ誘導(dǎo)自噬水平的升高;為了進(jìn)一步研究LUTG逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中選用NAC抑制細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS。DCFH-DA染色顯示NA

8、C能夠降低AngⅡ誘導(dǎo)的ROS含量，NAC和LUTG合用能夠協(xié)同降低AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS濃度，對(duì)正常細(xì)胞影響不大。Western blotting結(jié)果顯示，NAC單獨(dú)使用和NAC聯(lián)合LUTG使用均能夠降低AngⅡ處理組DNA雙鏈損傷蛋白γ-H2AX和Nrf2的表達(dá)，能夠降低自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)和LC3B2/LC3B1的比值，升高P62的表達(dá)，上調(diào)p-Akt、Akt、mTOR和p-mTOR的表達(dá)。結(jié)果顯示:LUTG可能

9、是通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生影響AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):C57BL/6J小鼠皮下注射AngⅡ(1.44mg/kg/d)構(gòu)建心肌肥厚模型，并持續(xù)灌胃給予LUTG(40mg/kg/d)8周。心臟形態(tài)拍照顯示:與溶劑對(duì)照組相比，模型組心臟體積增大，LUTG給藥組能減小心臟體積;HE染色的結(jié)果顯示:與溶劑對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞顏色變淡、細(xì)胞核增大、部分細(xì)胞接觸部分出現(xiàn)融合。結(jié)果表明:LUTG給藥組降低了心肌細(xì)胞病理