蠟梅(Chimonanthus praecox)金屬硫蛋白基因分子特征分析及在矮牽牛中的超表達效應的初步分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類富含Cys、能夠結合重金屬的低分子量蛋白質，廣泛分布于生物界。MT在提高植物重金屬抗性、解除對Cu、Zn、Pb、Ag、Hg、cd等重金屬毒性方面具有重要作用，多數(shù)MT在C端和N端有兩個富含Cys的結構域，其中的巰基既可以與重金屬離子螯合形成無毒或低毒的絡合物，還可以與重金屬等脅迫條件誘發(fā)產(chǎn)生的·OH發(fā)生氧化還原反應，從而降低氧化損傷。大量研究表明，植物金屬硫蛋白可以通過其大量的Cy

2、s殘基螯合重金屬并清除活性氧，使植物免受氧化損傷。近年來從植物中克隆到許多編碼金屬硫蛋白的基因，并在研究基因表達模式、組織表達特異性以及基因結構，如啟動子、內(nèi)含子在染色體上的定位等方面取得了一定進展，但對其功能的研究還處于起步階段。從本實驗室構建的臘梅花cDNA文庫中，利用EST技術從臘梅中克隆了金屬硫蛋白基因。通過生物信息學手段，對基因序列進行了分析和功能預測。為了進一步驗證其可能的功能，構建了一個植物表達載體，通過矮牽牛的轉化獲得了

3、一批轉基因植株，并對轉基因植株進行了初步分析，主要研究結果如下： 1．metallothionein及其編碼蛋白的生物信息學分析 利用DNAStar，DNAMAN等軟件分析克隆基因的序列，分析表明該cDNA序列長1083bp，其中ORF240bp，編碼79個氨基酸，該蛋白質的理論分子量為7.76kD，等電點為4.67。在NCBI上進行BLASTP比對，共有15條氨基酸序列與其有較高的同源性，排在第一位的是丹參中的puta

4、tive metallothionin2a蛋白質，相似性達96.7％。 2．表達載體的構建 metallothionein基因位于文庫克隆載體pTriplEx2上，活化菌液并用限制性內(nèi)切酶SfiI酶切，同時酶切添加了SfiI酶切位點的環(huán)狀pMD-18TM，回收目的片段和載體并連接，經(jīng)過酶切和PCR驗證，成功構建克隆載體；再用XbaI和SmaI分別雙酶切克隆載體和表達載體pC2301，回收目的片段和表達載體并連接，經(jīng)酶切

5、和PCR驗證，成功構建含有目的基因的表達載體。 3．根瘤土壤桿菌介導的遺傳轉化和Km+抗性矮牽牛植株的獲得 采用根瘤土壤桿菌介導的葉盤轉化法，將外源目的基因導入矮牽牛，得到了28株Km+再生植株。 4．轉基因矮牽牛的分子生物學鑒定 首先對篩選到的抗性植株進行GUS組織化學檢測，初步篩選并確定轉化植株。然后對GUS染色呈陽性植株再進行PCR檢測。結果表明GUS陽性株系均出現(xiàn)一條與陽性對照相同的特異帶，而非轉