金花茶體胚調控及SERK基因的克隆與定量表達分析.pdf

1、本研究以金花茶成年莖段誘導的胚性培養(yǎng)物為材料，進行體胚發(fā)生同步化調控和花狀多子葉形胚增殖系統(tǒng)的優(yōu)化；克隆金花茶體胚SERK基因，并采用實時熒光定量PCR技術進行金花茶體胚發(fā)生過程中SERK基因轉錄水平表達變化研究。主要研究結果如下：
　　 1、金花茶體胚發(fā)生同步化調控與花藥胚性愈傷組織的誘導
　　 以金花茶成年莖段誘導的胚性培養(yǎng)物為材料，進行體胚發(fā)生同步化調控，結果表明：在C1:MS+4％蔗糖+2％山露醇+6％瓊脂和C2

2、:MS+4％蔗糖+2％甘露醇+6％瓊脂培養(yǎng)基上獲得球形胚和心形胚同步化材料，在人為挑選和培養(yǎng)基調控相結合的基礎上，獲得子葉胚和成熟胚材料。同時，進行了金花茶花藥愈傷組織誘導。結果表明：金花茶花蕾低溫4℃預處理24h，接種于MS+2.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1KT能誘導出愈傷組織，之后挑選愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基MS+1.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1IAA可觀察到白色愈傷組織分化為綠色的生長點，經過篩選和形

3、態(tài)學觀察初步判斷為胚性愈傷組織。
　　 2、金花茶花狀多子葉形胚增殖系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 本試驗研究了不同濃度甜菜堿、PEG6000、激素組合對花狀多子葉形胚的誘導影響。結果表明：在0.8g·L-1甜菜堿+20g·L-1甘露醇的MS培養(yǎng)基上，心形胚誘導花狀多子葉形胚的效果最好，達到了86.6％。同時還促進次生胚的增殖；在PEG60007.5％+20g·L1甘露醇培養(yǎng)基上，花狀子葉胚的誘導率最高，達到76.9％。從以上調控培養(yǎng)

4、基上誘導的花狀多子葉形胚中挑選較成熟的體胚轉移至Y0培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.2mg/L+BA2mg/L)，體胚由黃色轉變?yōu)榧t色，最后在變紅的胚體表面又生長出較同步的次生胚。將其重新接種到原來培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40d后就可以獲得花狀多子葉胚，可重復這一發(fā)育途徑。
　　 3、金花茶體胚SERK基因克隆
　　 以金花茶球形胚為材料，進行SERK基因克隆。根據其他植物已知SERK基因序列設計引物，應用同源克隆結合RACE技術，

5、獲得了金花茶體胚SERK基因cDNA的保守區(qū)和3’序列。該目的片段經測序得到的長為1219bp，該序列與登錄GenBank其他植物SERK基因序列進行核苷酸比對發(fā)現，同源性85％-73％左右；經分析后發(fā)現金花茶體胚SERK基因編碼277個氨基酸，與GenBank其他植物SERK基因序列進行氨基酸序列比對，同源性較高。這也證明了金花茶體胚SERK基因存在保守性。4金花茶體胚發(fā)生過程中SERK基因表達的實時熒光定量PCR分析