豬NOBOX基因的克隆、生物信息學(xué)預(yù)測及定量表達分析.pdf

1、在哺乳動物生長、發(fā)育、細胞系定向分化等過程中，基因表達的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是非常重要的一個環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptional factor,TF）是結(jié)合于基因組基因調(diào)控區(qū)相應(yīng)調(diào)控元件而調(diào)控基因表達的反式作用因子，是轉(zhuǎn)錄起始過程中RNA聚合酶所需的輔助因子。真核生物基因在無轉(zhuǎn)錄因子時處于不表達狀態(tài)，RNA聚合酶自身無法啟動基因轉(zhuǎn)錄，只有當轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）結(jié)合在其識別的DNA序列上后，基因才開始表達。
　　 NOBOX（新生

2、兒卵巢同源盒基因）是生殖細胞特異性表達的，有關(guān)早期卵子發(fā)生的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。NOBOX基因首次在新生小鼠的卵巢中鑒定出。其RNA和蛋白質(zhì)優(yōu)先地表達于生殖腺內(nèi)的卵母細胞和濾泡各發(fā)育階段的原發(fā)性及生長中的卵母細胞中。研究證明NOBOX在卵泡早期發(fā)育階段發(fā)揮重要作用并被列為非綜合癥型卵巢早衰的候選基因。對NOBOX基因的克隆測序及初步分析，可為研究豬的NOBOX基因的生物學(xué)功能和科學(xué)育種提供基礎(chǔ)的基因信息，也為研究人類的卵巢早衰疾病建立動

3、物實驗?zāi)Ｐ吞峁┽t(yī)學(xué)參考.
　　 本文借鑒電子克隆的方法，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了豬NOBOX基因的cDNA全序列.利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了該蛋白的結(jié)果和功能，并進行了同源性序列多重比對和分子系統(tǒng)發(fā)生分析。利用實時熒光定量(Real-time)PCR技術(shù)分別分析了豬NOBOX基因的mRNA在不同組織樣本中的相對表達水平和卵母細胞與孤雌激活胚發(fā)育初期四個階段的mRNA的相對表達水平。
　　 1 NOBOX基因的

4、克隆測序
　　 分別用人和牛的NOBOX基因核苷酸序列通過NCBI上BLAST同源性檢索，獲得兩條相關(guān)的豬EST序列。將其下載到本地，基于此序列設(shè)計3′RACE引物，然后再根據(jù)3′RACE測序結(jié)果設(shè)計基因特異性5’RACE引物，利用RACE技術(shù)克隆測序，進一步驗證EST的正確性并獲得豬NOBOX基因的cDNA全序列，長度為1768bp。GenBank登錄號為FJ587509。
　　 2 NOBOX蛋白的生物信息學(xué)分析

5、r>　　 借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和軟件，預(yù)測出豬NOBOX基因開放閱讀框的長度為1419bp，編碼472個氨基酸殘基，且兩側(cè)分別是26bp的5UTR和323bp的3UTR。通過對蛋白序列相似性檢索，預(yù)測出豬NOBOX蛋白不含有信號肽，不含有跨膜區(qū)，定位于細胞核中，而且確定其含有一個cd00086保守結(jié)構(gòu)域。推測豬NOBOX蛋白具有DNA結(jié)合活性，參與染色質(zhì)修飾和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 3 Real-time PCR分析NOBOX

6、基因的表達
　　 采用實時熒光定量PCR技術(shù)，分別分析了豬NOBOX不同組織中的相對表達水平及卵母細胞和在孤雌激活胚中不同發(fā)育階段的表達差異，結(jié)果表明：NOBOX基因在豬的不同組織中廣泛表達，但表達水平存在差異。NOBOX基因在心臟、腎臟和卵母細胞中表達水平較高，推測該基因在心臟、腎臟和卵母細胞的發(fā)育和功能維持過程具有重要作用；NOBOX基因在胚胎發(fā)育期（4細胞期胚胎、8細胞期胚胎、桑葚胚和囊胚）的表達水平明顯高于GV期卵母細胞