TFPI-2基因的克隆表達及其與肝癌關(guān)系的研究.pdf

1、目的：克隆中國人的TFPI-2基因(全長cDNA)，并將之亞克隆至哺乳動物表達載體并在細胞中表達，以此獲得首個中國人TTPI-2的cDNA克隆；通過轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2，研究TFPI-2的表達對其侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，探討TFPI-2在肝癌這一類具高度侵襲、轉(zhuǎn)移性腫瘤中的作用；為尋找新的抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的治療方法提供思路。 方法：第一階段：提取人肝臟總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增出TFPI-2的全長cDNA；PCR產(chǎn)物插入載體

2、PCR2.1中，選擇轉(zhuǎn)化克隆進行酶切鑒定，DNA測序并和GeneBank中報道的TFPI-2序列比較，肯定克隆結(jié)果。用內(nèi)切酶切下TTPI-2的cDNA，亞克隆至高效的哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1中。第二階段：酶切鑒定后，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000把TFPI-2-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入HepG2細胞中進行瞬間高效表達，Western blot檢測其表達效果。同時使用G418篩選穩(wěn)定表達的細胞系。第三階段：以TFPI

3、-2 cDNA為探針，檢測TFPI-2基因在正常人肝組織、硬化肝、肝癌組織中表達的差異。用腫癌細胞趨化性試驗來檢測轉(zhuǎn)染前后HepG2細胞趨化性變化；用腫瘤侵襲試驗觀察轉(zhuǎn)染前后HepG2細胞的侵襲力改變。 結(jié)果：本研究克隆的中國人TFPI-2基因cDNA全長1222bp，除258、585和884 bp處與目前Genbank中收錄的國外學(xué)者克隆的TFPI-2基因序列不同外，其他完全一致。序列Genbank登記號：TFPI AY691

4、946。TFPI-2成功插入pcDNA3.1表達載體，酶切鑒定其長度和方向均正確，測序結(jié)果也證實其正確的載入。將重組的TFPI-2-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入HepG2細胞，轉(zhuǎn)染成功的HepG2細胞經(jīng)證實有TFPI-2 mRNA和相應(yīng)蛋白的表達；而未轉(zhuǎn)染的HepG2細胞沒有觀察到TFPI-2的表達。轉(zhuǎn)染TFPI-2的肝癌細胞HepG2其遷徙能力無明顯變化(穿膜細胞數(shù)為115.3±6.0 vs 121.7±7.1，P>0.05)，但是其細胞體