SSH篩選濟(jì)寧青山羊性早熟相關(guān)基因及KiSS-1、GPR54、Lin28B基因的研究.pdf

1、本研究分為兩部分:
　　 第一部分:
　　 縮短母羊的初情期,有助于減少后備母羊的生產(chǎn)投入。濟(jì)寧青山羊是一個(gè)性早熟的山羊品種。本部分研究旨在利用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)篩選濟(jì)寧青山羊性早熟相關(guān)基因,為進(jìn)一步深入開展山羊性早熟的分子機(jī)理研究及通過遺傳選擇縮短山羊初情期提供理論基礎(chǔ)。
　　 應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了濟(jì)寧青山羊與遼寧絨山羊幼年期、初情期、初情期同齡對(duì)照間下丘腦、垂體、卵巢.子宮、腎上腺的消減cD

2、NA文庫,并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。取得結(jié)果如下:
　　 1.應(yīng)用SSH技術(shù)構(gòu)建濟(jì)寧青山羊與遼寧絨山羊幼年期、初情期、初情期同齡對(duì)照間下丘腦、垂體、卵巢-子宮、腎上腺共12個(gè)正向消減cDNA文庫,以GAPDH為指標(biāo)檢測(cè)消減文庫的消減效率在25以上,表明差異表達(dá)基因得到了有效的富集。經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定,插入片段大小在250—900 bp之間。
　　 2.12組消減文庫中共獲得2046條差異表達(dá)EST,其中包括幼

3、年期698條、初情期對(duì)照623條、初情期725條,在每個(gè)發(fā)育時(shí)期下丘腦和垂體中獲得的差異表達(dá)EST多些,卵巢一子宮和腎上腺中較少一些。對(duì)各組差異表達(dá)EST按照已知基因、已知EST和未知EST進(jìn)行了分類,并對(duì)差異表達(dá)EST進(jìn)行了出現(xiàn)頻次統(tǒng)計(jì)。
　　 3.將各組已知基因進(jìn)行了在線功能分類。根據(jù)PANTHER數(shù)據(jù)庫分析,差異表達(dá)基因主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞間通訊、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制／轉(zhuǎn)錄／翻譯相關(guān)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、代謝、細(xì)胞與機(jī)體防御。根據(jù)

4、COG分類結(jié)果,獲得的差異表達(dá)基因涉及細(xì)胞進(jìn)程與信號(hào)、信息儲(chǔ)存與加工、代謝3大類,含16小類。
　　 4.將已知基因提交KEGG Palthway數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因參與最多的是Metabolic pathways,其次是Parkinson’s disease和Oxidative phosphorylation。
　　 5.將已知基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)獲得的差異表達(dá)基因形成了核糖體結(jié)構(gòu)／蛋白質(zhì)翻

5、譯和氧化磷酸化兩個(gè)主要的作用網(wǎng)絡(luò)。
　　 第二部分:
　　 KISS-1和GPR54是調(diào)控動(dòng)物初情期啟動(dòng)的重要基因。Lin28B基因內(nèi)或附近的變異與女孩月經(jīng)初潮年齡在基因組水平上相關(guān)。本部分研究旨在尋找新的山羊性早熟相關(guān)基因,了解其作用機(jī)制,期望能夠用于縮短山羊初情期的分子育種。
　　 試驗(yàn)一:克隆了山羊KiSS-1基因4118 bp的序列,預(yù)測(cè)含408 bp的ORF,編碼135 aa。該蛋白質(zhì)含有一個(gè)17 aa

6、的信號(hào)肽,是一個(gè)分泌型蛋白。其序列與牛、綿羊的同源性較高,分別為91.11％和95.24％,與人、小鼠、大鼠、豬的同源性較低,分別為60.53％、58.12％、59.66％、72.50％。在山羊KiSS-1內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)(G296C、G454T和T505A),外顯子2中沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn),內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)一個(gè)18 bp缺失(-)／插入(+)突變(1960-1977),外顯子3中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變位點(diǎn)(G3433A[A86T]和C368

7、8A)。這些突變位點(diǎn)在性早熟和性晚熟山羊品種之間的基因型分布沒有規(guī)律性差異。296位點(diǎn)CC型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)比GG、GC型分別多0.80只(P<0.01)和0.77只(P<0.01),GG與GC基因型個(gè)體間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。1960-1977位點(diǎn)-／-個(gè)體比+／+、+／+個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)分別多0.77只(P<0.01和0.73只(P<0.01),+／+與+／-間差異不顯著。其他4個(gè)位點(diǎn)基因型間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。本研究初步表明山羊KiSS-1基

8、因296位點(diǎn)C等位基因和1960-1977位點(diǎn)的(-)等位基因可能與濟(jì)寧青山羊的高產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。
　　 試驗(yàn)二:克隆了山羊GPR54基因4258 bp的序列,預(yù)測(cè)含1137 bp的ORF,編碼378 aa,含有7個(gè)跨膜域。該蛋白序列與牛、綿羊的同源性最高,分別為94.57％和99.58％,和人、小鼠、大鼠、豬的同源性較高,分別為86.69％、84.88％、82.47％、88.99％。山羊GPR54基因外顯子1-4上沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)

9、,外顯子5上發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)(G4014A[G328D]、G4136A[G368S]和C4152T[P373L],這3個(gè)突變位點(diǎn)可能與濟(jì)寧青山羊的性早熟有一定關(guān)系。4152位點(diǎn)的TT和CT型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)比CC型分別多1.02(P(0.01)和0.84(P<0.01),TT與CT基因型個(gè)體間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。其他兩個(gè)位點(diǎn)基因型間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。本研究初步表明山羊GPR54基因4152位點(diǎn)T等位基因可能與濟(jì)寧青山羊的高產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。

10、r>　　 試驗(yàn)三:克隆獲得山羊Lin28B基因mRNA序列916 bp,含有744 bp的CDS區(qū),編碼247 aa,預(yù)測(cè)山羊Lin28B蛋白含有一個(gè)冷休克結(jié)構(gòu)域和一對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)域。該蛋白序列與人、獼猴、大鼠、小鼠、牛的同源性分別為90.80％、90.32％、76.19％、76.92％和94.09％。山羊Lin28B存在可變剪接,剪接位點(diǎn)發(fā)生在內(nèi)含子3中,并且內(nèi)含子3的3’-端含有一個(gè)微衛(wèi)星序列。測(cè)序在外顯子1-3上未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn),在外

11、顯子4上發(fā)現(xiàn)9個(gè)突變位點(diǎn)(G911A、C1026T、A2934T、C3053T、G3248A、C3414G、A3770T、C4478T和G4742A),全部位于3’-UTR。對(duì)其中8個(gè)位點(diǎn)在12個(gè)山羊品種中進(jìn)行了檢測(cè),這8個(gè)位點(diǎn)的基因型分布在性早熟山羊品種和性晚熟山羊品種中沒有明顯規(guī)律。2934位點(diǎn)TT和AT基因型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)比AA基因型分別多0.83只(P<0.01)和0.48只(P<0.05),TT與AT基因型個(gè)體間差異不顯著,