BV2小鼠小膠質(zhì)細胞株GPR17基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及其功能鑒定.pdf

1、研究背景：
　　 小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)的免疫、炎癥相關細胞?！办o息態(tài)”小膠質(zhì)細胞缺乏吞噬功能，但在病理條件(如腦缺血后繼發(fā)性炎癥以及退行性腦變性疾病)時，則變形為阿米巴樣，可以吞噬死亡細胞，清除細胞殘骸，參與調(diào)節(jié)組織修復、放大炎癥反應、神經(jīng)元變性等，對包括嘌呤、嘧啶類似物、補體、細胞因子和趨化因子等物質(zhì)均有反應。
　　 花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶(5-lipoxygenase)代謝產(chǎn)生半胱氨酰白三烯(cysteinylleuko

2、trienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)是一類重要的炎癥介質(zhì)。腦缺血以及脊髓外傷后均有半胱氨酰白三烯類物質(zhì)釋放，通過激活其受體產(chǎn)生多種效應。半胱氨酰白三烯受體有CysLT1和CysLT2受體兩種經(jīng)典的亞型。近來報道GPR17(Gprotein-coupledreceptor17)是一種尿嘧啶核苷酸/半胱氨酰白三烯雙重受體，能被尿嘧啶核苷酸類物質(zhì)(UDP，UDP-glucose和UDP-galactose)和Cys

3、LTs激活。目前，GPR17的研究較少，因此，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPR17真核表達質(zhì)粒的細胞株，可為研究其功能奠定基礎。
　　 GPR17在容易遭受缺血性損傷的器官(即腦、心和腎)呈高表達，在應激或者病理條件下起重要的調(diào)節(jié)作用。正常腦內(nèi)，GPR17主要表達在神經(jīng)元以及少突膠質(zhì)細胞前體細胞上，在星形膠質(zhì)細胞上沒有表達。大鼠局灶性腦缺血后，GPR17主要表達在激活的小膠質(zhì)細胞，并且缺血中心區(qū)GPR17mRNA和蛋白的表達在12-24h和7

4、-14d呈現(xiàn)兩個高峰，在周邊區(qū)只在7-14d時有表達上調(diào)。
　　 小膠質(zhì)細胞除了表達GPR17和半胱氨酰白三烯受體之外，還表達其他核苷酸P2受體。GPR-17作為一種新型半胱氨酰白三烯/尿嘧啶核苷酸雙重受體，負調(diào)控CysLT1受體的作用已得到闡述，但在小膠質(zhì)細胞上有無這種作用還不明確，因此，需要在小膠質(zhì)細胞進行研究。
　　 目的：
　　 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mGPR17的BV2細胞，并在此基礎上研究mGPR17激活后對B

5、V2細胞吞噬功能的影響。
　　 方法：
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pcDNA3.1-mGPR17轉(zhuǎn)到BV2細胞中，并用350μg/mlG418篩選得到陽性單克隆細胞株。RT-PCR、免疫熒光法以及Westernblotting方法檢測mGPR17表達，F(xiàn)luo-4測定激動劑UDP或者LTD4處理后細胞內(nèi)鈣變化，免疫熒光計數(shù)法或者流式細胞術，檢測給予CysLT1受體拮抗劑pranlukast或siRNA敲低GPR17后，

6、對激動劑UDP、LTD4誘導BV2細胞吞噬功能的作用。
　　 結(jié)果：
　　 RT-PCR、免疫熒光法以及Westernblotting結(jié)果表明，重組的真核表達載體pcDNA3.1(+)-mGPR17在BV2細胞獲得表達。加入外源性激動劑UDP或LTD4后，3種BV2細胞(BV2-WT細胞、BV2-pcDNA3.1細胞、BV2-mGPR17細胞)的熒光強度比值F/F0(F代表給予激動劑之后120s內(nèi)的最大熒光強度值，F(xiàn)0代

7、表給予激動劑之前各個時間點的平均熒光強度值)沒有顯著性差異，但是，UDP誘導BV2-mGPR17細胞的反應性細胞數(shù)顯著增加，曲線下面積顯著增加，BV2-pcDNA3.1細胞的反應性細胞數(shù)顯著減少；而LTD4誘導BV2-mGPR17細胞的反應性細胞數(shù)減少，曲線下面積顯著減少。BV2-mGPR17細胞表達的CysLT1受體顯著下調(diào)。BV2-mGPR17細胞的自發(fā)吞噬能力減弱，UDP或者LTD4誘導BV2-mGPR17細胞的吞噬能力減弱。