白三烯D4激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的作用.pdf

1、研究背景：
　　 半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)是5-脂氧酶-花生四烯酸代謝途徑來(lái)源的一類(lèi)重要炎癥介質(zhì)。CysLTs通過(guò)激活半胱氨酰白三烯受體(cysteinylleukotrienesreceptor，CysLT受體，包括兩種主要亞型CysLT1和CysLT2受體)參與調(diào)節(jié)體內(nèi)諸多病理生理過(guò)程，如腦缺血、腦外傷等。
　　 以往研究發(fā)現(xiàn)：在整體

2、腦缺血損傷過(guò)程中，腦內(nèi)半胱氨酰白三烯含量增高，半胱氨酰白三烯受體可介導(dǎo)缺血后神經(jīng)元損傷；給予小鼠皮層注射白三烯D4，可誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷。然而，離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白三烯D4不能直接誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷。據(jù)以上整體與離體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致，我們推測(cè)：白三烯D4誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的作用，可能是間接通過(guò)腦內(nèi)的其他類(lèi)型細(xì)胞，如腦內(nèi)參與炎癥調(diào)節(jié)的主要細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷，腦內(nèi)炎癥時(shí)迅速激活，對(duì)于腦缺血后炎癥進(jìn)程有重要影響。然而，C

3、ysLTs是否參與激活小膠質(zhì)細(xì)胞及其激活小膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制，尚待闡明。
　　 研究目的：
　　 觀察白三烯D4激活小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，并初步探討白三烯D4激活BV2細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.以KLH偶聯(lián)的CysLT1受體多肽(小鼠)免疫家兔制備兔抗小鼠CysLT1受體多克隆抗體，用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，以抗原阻斷法測(cè)定抗體敏感性及特異性；
　　 2.以RT-PCR、W

4、esternblotting檢測(cè)BV2細(xì)胞半胱氨酰白三烯受體CysLT1和CysLT2mRNA和蛋白的表達(dá)；以細(xì)胞免疫染色法觀察CysLT1、CysLT2的亞細(xì)胞定位；
　　 3.BV2細(xì)胞以不同濃度(0-100nM)白三烯D4(LTD4)作用24h，光鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化；以CCK法檢測(cè)細(xì)胞活性變化以反映細(xì)胞增殖；以熒光微珠示蹤法檢測(cè)BV2細(xì)胞吞噬變化。
　　 4.以CysLT1受體選擇性拮抗劑Monteluka

5、st(1-1000nM)、CysLT2受體選擇性拮抗劑HAMI3379(10-10000nM)和CysLT1/CysLT2受體雙重拮抗劑BAYu9773(1-1000nM)在預(yù)處理30分鐘后再給予LTD4作用24h(期間拮抗劑全程給藥)，以熒光微珠追蹤法檢測(cè)細(xì)胞吞噬變化，以RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-β和IL-6的mRNA表達(dá)水平變化。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.成功制備了兔抗小鼠CysLT1受體多

6、克隆抗體，ELISA測(cè)定顯示，制備的家兔抗小鼠CysLT1受體抗體的效價(jià)大于1/32728，對(duì)CysLT1受體的特異性強(qiáng)，對(duì)CysLT2受體和GPR17基本無(wú)交叉反應(yīng)；
　　 2.BV2細(xì)胞在mRNA和蛋白水平表達(dá)CysLT1、CysLT2；免疫染色顯示CysLT1、CysLT2受體主要表達(dá)在胞膜；
　　 3.LTD4作用24h，BV2細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，BV2細(xì)胞活性無(wú)明顯變化。
　　 4.LTD4(100nM

7、)作用24h，能顯著提高BV2細(xì)胞的吞噬能力、上調(diào)IL-6的mRNA表達(dá)，但不誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β的表達(dá)上調(diào)；
　　 5.CysLT1受體選擇性拮抗劑Montelukast(100nM)，CysLT2選擇性拮抗劑HAM13379(100,1000和10000nM)以及CysLT1/CysLT2受體雙重拮抗劑BAYu9773(100nM)預(yù)給藥30min后，再給予LTD4100nM作用24h，能進(jìn)一步增強(qiáng)吞噬；BAYu977

8、3(1nM)能拮抗LTD4誘導(dǎo)的吞噬；
　　 6.CysLT1受體選擇性拮抗劑Montelukast(1nM)，CysLT1/CysLT2受體雙重拮抗劑BAYu9773(1nM和10nM)處理可減弱LTD4100nM誘導(dǎo)的IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)，而不同濃度的CysLT2選擇性拮抗劑HAMI3379對(duì)此沒(méi)有影響。
　　 結(jié)論：
　　 LTD4可激活小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)和炎癥細(xì)胞因子IL-6