小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型的建立及海風(fēng)藤影響作用的研究.pdf

1、背景：阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚，研究者提出了多種可能的假說(shuō)。其中，炎癥學(xué)說(shuō)在體內(nèi)和體外研究中均取得了可信的證據(jù)。目前已知，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠被神經(jīng)炎性斑的主要成分β淀粉樣蛋白(Aβ)激活。迄今為止，人們尚未找到特異性治療AD的有效方法。海風(fēng)藤是一種用于治療跌打損傷、哮喘等疾病的傳統(tǒng)中藥，最近的研究發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤提取物能夠抑制β淀粉樣前體蛋白(β-APP)基因的表達(dá)和Aβ的合成，但對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨欠裼杏绊?，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)類(lèi)似

2、研究。
　　 目的：體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，研究纖絲狀和寡聚體β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)25-35對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，以及海風(fēng)藤提取物對(duì)纖絲狀和寡聚體Aβ25-35激活小膠質(zhì)細(xì)胞作用的影響。
　　 方法：取新生大鼠的大腦組織，制備成細(xì)胞懸液后進(jìn)行混合細(xì)胞培養(yǎng)，再將小膠質(zhì)細(xì)胞從混合培養(yǎng)的細(xì)胞群中分離。以CD11b為特異性抗原標(biāo)志，利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞。分別用纖絲狀A(yù)β25-35、寡聚體Aβ

3、25-35、纖絲狀A(yù)β25-35+海風(fēng)藤提取物、纖絲狀A(yù)β25-35+DMSO、寡聚體Aβ25-35+海風(fēng)藤提取物以及寡聚體Aβ25-35+DMSO干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組。干預(yù)48小時(shí)后，倒置相差顯微鏡下觀察不同處理組小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。以CD68作為小膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性抗原標(biāo)志，利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)行定性檢測(cè)，并比較不同處理組間的差異。
　　 結(jié)果：1）通過(guò)CD11b免疫細(xì)胞化學(xué)染色，證

4、實(shí)分離得到的細(xì)胞主要為小膠質(zhì)細(xì)胞，CD11b表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)到98％，而以PBS代替一抗的陰性對(duì)照組CD11b表達(dá)陽(yáng)性率僅有5.4％，P＜0.05。2)干預(yù)48小時(shí)后，纖絲狀A(yù)β25-35及寡聚體Aβ25-35組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，胞體增大，突起回縮變短，呈阿米巴樣改變，為典型的激活后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。而纖絲狀A(yù)β25-35+海風(fēng)藤提取物和寡聚體Aβ25-35+海風(fēng)藤提取物組的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化則不如上述兩組明顯。3）CD68免疫細(xì)

5、胞化學(xué)染色顯示，每組小膠質(zhì)細(xì)胞都有一定程度的活化，但各組小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD68的陽(yáng)性率不同，P＜0.05。六個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)陽(yáng)性率均高于空白對(duì)照組(5.1％)，P＜0.004。寡聚體Aβ25-35組的CD68表達(dá)陽(yáng)性率(71.2％)高于纖絲狀A(yù)β25-35組(60.8％)，P＜0.002。纖絲狀A(yù)β25-35+海風(fēng)藤提取物組CD68表達(dá)陽(yáng)性率(52.1％)低于纖絲狀A(yù)β25-35組(60.8％)，P＜0.002。寡聚體A

6、β25-35組(71.2％)和寡聚體Aβ25-35+海風(fēng)藤提取物組(67.0％)的CD68表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，P=0.005。
　　 結(jié)論：1）成功進(jìn)行了小膠質(zhì)細(xì)胞的體外分離純化培養(yǎng)，該方法獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞純度高，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。2)證實(shí)纖絲狀A(yù)β25-35和寡聚體Aβ25-35均能激活小膠質(zhì)細(xì)胞，且寡聚體Aβ25-35激活小膠質(zhì)細(xì)胞的能力強(qiáng)于纖絲狀A(yù)β25-35。3）排除了溶劑DMSO的影響后，證實(shí)海風(fēng)藤提取物能夠抑