小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和抑制在大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型中的作用研究.pdf

1、第一部分:視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型中的作用
　　 選用成年雄性SD大鼠,予縫線開瞼,1％阿托品擴(kuò)瞳,經(jīng)24h暗適應(yīng)后,放入光照箱中接受24 h強(qiáng)度為2500Lux的寬譜藍(lán)光照射。在光照后的3d、7d、14d應(yīng)用光鏡、TUNEL染色、透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的改變及細(xì)胞凋亡情況;應(yīng)用閃光ERG評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能。結(jié)果顯示:光照后視網(wǎng)膜光感受器的內(nèi)外節(jié)破壞,外核層排列紊亂,核質(zhì)固縮,核層逐漸變薄,14d時(shí)減少達(dá)6

2、0.09％;光照后1d,外核層出現(xiàn)大量TUNEL(+)細(xì)胞,進(jìn)一步經(jīng)透射電鏡證實(shí)光感受器的死亡方式為凋亡;光照后14d,視網(wǎng)膜功能顯著下降,0dB光照強(qiáng)度不能誘導(dǎo)出Photic-ERG波形;模型眼出現(xiàn)與視網(wǎng)膜色素變性相似的以凋亡為特征的光感受器變性。
　　 在成功建立了大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型后,我們又進(jìn)一步研究了實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜光損傷模型中小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、活化及其與光感受器凋亡的關(guān)系。光照后2h、6h、1d、3d、7d、14d,采用

3、免疫熒光染色觀察兩組大鼠視網(wǎng)膜OX42(+)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)的形態(tài)改變、遷移活動(dòng),并對(duì)視網(wǎng)膜外層的TUNEL(+)細(xì)胞和OX42(+)細(xì)胞分別計(jì)數(shù)并繪制時(shí)間變化曲線,分析兩者的關(guān)系,同時(shí)用ED1抗體尋找可能的血源性巨噬細(xì)胞;用透射電鏡觀察進(jìn)入光感受器層的小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬行為;用Real-time PCR和Western-blot法對(duì)光照后視網(wǎng)膜膠質(zhì)源性致炎因子及神經(jīng)毒性物質(zhì)IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)變化進(jìn)行定量分析。
　　

4、 結(jié)果顯示:光照后2h視網(wǎng)膜外核層即可見TUNEL(+)細(xì)胞,1d時(shí)達(dá)高峰,3d后逐漸減少;光照后6h視網(wǎng)膜外核層開始出現(xiàn)少量OX42(+)細(xì)胞,逐漸增多并于3d時(shí)達(dá)高峰,7d后漸消失,從時(shí)間變化曲線可見OX42(+)細(xì)胞的遷移高峰落后并緊隨凋亡高峰;視網(wǎng)膜鋪片中見OX42(+)細(xì)胞由呈小細(xì)胞體和細(xì)的分支突觸的靜息形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀蠹?xì)胞體的激活形態(tài);強(qiáng)光照射上調(diào)了視網(wǎng)膜IL-1βmRNA及蛋白的表達(dá),其時(shí)間變化趨勢(shì)同小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和遷移趨

5、勢(shì)基本一致;透射電鏡顯示進(jìn)入外核層的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬了光感受器的外節(jié)膜盤;光照后的晚期由于血視網(wǎng)膜屏障的破壞,極少量的血源性巨噬細(xì)胞向視網(wǎng)膜外層浸潤。
　　 本部分的研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜光損傷模型中光感受器的凋亡誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞向外層的遷移、活化及吞噬行為的發(fā)生,并伴有膠質(zhì)源性神經(jīng)毒性物質(zhì)IL-1β的上調(diào),提示小膠質(zhì)細(xì)胞在加速光感受器變性過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 第二部分:納洛酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

6、r>　　 原代培養(yǎng)并分離純化視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞,利用脂多糖(LPS)建立體外激活模型,分為接受不同濃度(-)-naloxone及其異構(gòu)體(+)-naloxone預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,采用OX42免疫熒光染色觀察naloxone對(duì)LPS激活的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響;用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)naloxone對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β的影響;用MTT比色法觀察naloxone對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。
　　

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞呈典型的激活形態(tài),表現(xiàn)為胞體顯著增大,胞膜突起變粗、皺褶,OX42陽性染色明顯增強(qiáng),呈“水母狀”,1μM的(-)-naloxone及其異構(gòu)體(+)-naloxone預(yù)處理30min則顯著抑制了LPS引起的此種形態(tài)學(xué)變化,表現(xiàn)為更接近于對(duì)照組的輕度激活形態(tài);此外naloxone預(yù)處理能顯著減少LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β的增多,從量效曲線上看,naloxone對(duì)LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1

8、β的抑制作用呈一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性,以1μM、12h效果最為明顯,且異構(gòu)體具有等效性;MTT比色法顯示0.25μM～1.25μM naloxone對(duì)≤100ng/ml LPS處理的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量無明顯影響。
　　 本部分的研究發(fā)現(xiàn)naloxone能夠有效抑制LPS活化的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化及IL-1β的產(chǎn)生;一定濃度下的naloxone對(duì)LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖無明顯影響,提示功能抑制;naloxone及其異

9、構(gòu)體對(duì)抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化及IL-1β的產(chǎn)生具有等效性,提示其抑制作用可能與阿片受體無關(guān)。
　　 第三部分:納洛酮對(duì)視網(wǎng)膜光損傷模型中光感受器變性的神經(jīng)保護(hù)作用
　　 SD大鼠接受2500Lux的寬譜藍(lán)光照射24h制成光損傷模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠于光照前2d接受不同劑量naloxone腹腔注射直至光照后2周,而對(duì)照組則接受等量的PBS腹腔注射。用組織學(xué)和視覺電生理的方法來評(píng)價(jià)naloxone對(duì)光照引起的光感受器變性的

10、神經(jīng)保護(hù)作用;用TUNEL染色觀察naloxone對(duì)光照后光感受器凋亡的影響;用免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜OX42(+)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)的遷移活動(dòng),用Western-blot來檢測(cè)光照后視網(wǎng)膜IL-1β蛋白含量的變化。
　　 結(jié)果顯示PBS治療組在光照后的14d,視網(wǎng)膜外核層顯著變薄,而接受1mg/dnaloxone腹腔注射的實(shí)驗(yàn)組無論是上方或下方的視網(wǎng)膜其外核層厚度都得到了較好的保留,后極部尤其明顯。Naloxone的神經(jīng)保護(hù)作

11、用顯示了良好的劑量依賴性,其中又以1mg/day效果最為理想;而在相同的時(shí)間點(diǎn),naloxone治療組其ERG最大混合反應(yīng)的a波、b波振幅較光照前自身基線水平的下降程度均較對(duì)照組低;免疫熒光染色顯示naloxone處理組遷移入外核層的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少,而視網(wǎng)膜IL-1β蛋白水平在兩組間的差異也與此吻合;TUNEL染色顯示naloxone能夠減少光照后3～7d光感受器的凋亡。
　　 本部分的研究發(fā)現(xiàn)naloxone能夠