白藜蘆醇對大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制作用的機(jī)理研究.pdf

1、隨著社會的發(fā)展，顱腦損傷的發(fā)生率、致死率和致殘率均逐年增加，顱腦損傷依然是威脅人類健康的主要疾患之一。近年來，顱腦創(chuàng)傷的救治成功率雖然有所提高，但顱腦創(chuàng)傷的機(jī)理研究仍有必要。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布較廣，在神經(jīng)元的生理活動(dòng)中起著支持、營養(yǎng)、保護(hù)及修復(fù)等重要功能，是神經(jīng)系統(tǒng)不可缺少的成分。對于小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥、癲癇、帕金森氏病、缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用研究較多，但在腦外傷中的作用研究較少，外傷后腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞是否對損傷刺激起反應(yīng)

2、，反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的分布有無區(qū)域特點(diǎn)，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)上有何改變以及時(shí)間過程，目前均未見到報(bào)道。因此，研究小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷的關(guān)系，充分發(fā)揮其保護(hù)作用，盡可能降低其損害作用，有助于提高神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷的救治效果。白藜蘆醇是—類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物，具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗癌、抗氧化、心血管保護(hù)等眾多作用，深入研究白藜蘆醇在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的作用和機(jī)制具有重要的臨床意義。實(shí)驗(yàn)通過改良Feeney

3、法獲得局灶性顱腦損傷動(dòng)物模型，對不同組動(dòng)物用白藜蘆醇干預(yù)，通過免疫組織化學(xué)染色法，觀察傷后OX-42陽性小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化；用原位末端標(biāo)記法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡的規(guī)律及用放射免疫法檢測血清促炎性因子的變化趨勢，探討顱腦損傷的發(fā)病機(jī)制及白藜蘆醇的藥理作用，以期獲得高效、低毒、價(jià)廉的潛在性臨床藥物。 一、大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)程及形態(tài)變化研究目的探討大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)程及形態(tài)變化。方法采用改良的Feeney's自由落

4、體損傷模型，35只SD大鼠隨機(jī)分為對照組和創(chuàng)傷組，后者根據(jù)傷后處死時(shí)間點(diǎn)不同，再分為傷后1h，6h，12h，24h，48h和72h組，每組動(dòng)物5只，在傷后不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取傷區(qū)腦組織行抗OX-42免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果正常大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞一般為靜息狀態(tài)，OX-42為陰性，在切片上不易發(fā)現(xiàn)或細(xì)胞形態(tài)不清晰；傷后1h，小膠質(zhì)細(xì)胞為靜息狀態(tài)，OX-42陰性，傷后6h小膠質(zhì)細(xì)胞為輕度反應(yīng)，OX-42淺染，細(xì)胞形態(tài)隱約可見，不規(guī)則；傷后12

5、h，小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)明顯，由靜息狀態(tài)變?yōu)樵缙诜磻?yīng)狀態(tài)，OX-42深染，細(xì)胞形態(tài)清楚；傷后24h，小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)達(dá)高峰，細(xì)胞形態(tài)更清楚，突起上可見到小棘；48h以后，反應(yīng)減弱，OX-42淺染，細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)論大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，海馬區(qū)亦有激活改變；反應(yīng)的時(shí)程變化是傷后6h出現(xiàn)激活，12h反應(yīng)明顯，24h達(dá)高峰，以后逐漸減弱。 本實(shí)驗(yàn)揭示了局灶性腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)激活情況和形態(tài)變化特征，為進(jìn)一

6、步研究小膠質(zhì)細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)資料。 二、白藜蘆醇對大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活影響的實(shí)驗(yàn)研究目的檢測白藜蘆醇治療前后大鼠傷區(qū)腦組織激活小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量改變情況，以探討白藜蘆醇的腦保護(hù)作用。方法健康雄性SD大鼠75只，隨機(jī)分為創(chuàng)傷組、對照組、治療組，每組分傷后3h、12h、24h、48h、72h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各時(shí)間點(diǎn)每組動(dòng)物5只，改良Feeney法自由落體致傷動(dòng)物。治療組白藜蘆醇(50mg/kg體重)腹腔注射治療，對照組給予等量生

7、理鹽水治療，創(chuàng)傷組未給予藥物處理，分別于傷后各時(shí)間點(diǎn)麻醉動(dòng)物，斷頭取傷區(qū)腦組織，抗OX-42免疫組化法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞變化情況。結(jié)果傷后早期小膠質(zhì)細(xì)胞即被激活，不同時(shí)間點(diǎn)，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不同。傷后各時(shí)間點(diǎn)治療組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)，創(chuàng)傷組與對照組無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論傷后不同時(shí)間點(diǎn)激活小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目不同，白藜蘆醇能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，有腦保護(hù)作用。 三、白藜蘆醇對大鼠腦創(chuàng)傷后傷區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞

8、凋亡的影響目的探討白藜蘆醇對大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。方法采用改良的Feeney自由落體腦損傷模型，對顱腦損傷大鼠用白藜蘆醇(50mg/kg體重)腹腔注射治療，傷前一天治療一次，傷后每天治療一次，直至處死動(dòng)物，應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)及免疫組織化學(xué)方法檢測受損腦組織治療前后TUNEL、Bcl-2及Bax的表達(dá)變化。結(jié)果治療組大鼠腦組織TUNEL及Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)低于創(chuàng)傷組及對照組(P＜0.05)，Bcl

9、-2的表達(dá)傷后持續(xù)升高，治療組高于與對照組和創(chuàng)傷組(P＜0.05)，創(chuàng)傷組和對照組之間無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論白藜蘆醇具有抗凋亡作用，可能是通過抑制促凋亡因素，促進(jìn)抑凋亡因素表達(dá)來減少顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。 四、白藜蘆醇對大鼠腦創(chuàng)傷后炎性因子影響的實(shí)驗(yàn)研究目的檢測白藜蘆醇治療前后大鼠血清促炎性因子TNF-α和IL-1β的濃度變化，以探討白藜蘆醇的腦保護(hù)作用。方法SD大鼠75只，隨機(jī)分為創(chuàng)傷組、對照組、

10、治療組，每組分傷后3h、12h、24h、48h、72h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各時(shí)間點(diǎn)每組動(dòng)物5只，F(xiàn)eeney法自由落體致傷動(dòng)物，治療組給予白藜蘆醇(50mg/kg體重)腹腔注射治療，傷前一天治療一次，傷后每天治療一次，直至采血時(shí)間點(diǎn)；對照組同法給予等量生理鹽水治療；創(chuàng)傷組不予治療，正常喂食水。分別于傷后各時(shí)間點(diǎn)股靜脈取血，靜置分層后離心，取血清低溫保存，放射免疫法檢測血清TNF-α和IL-1β濃度。結(jié)果傷后治療組TNF-α和IL-1β濃度比對

11、照組明顯降低(P＜0.05)，TNF-α和IL-1β在外傷組與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論白藜蘆醇可以減少傷后血清TNF-α和IL-1β濃度，對腦創(chuàng)傷有保護(hù)作用。 總結(jié)1、本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)觀察了大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)程及形態(tài)變化規(guī)律，主要表現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞在傷后不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)變化不同，并證實(shí)應(yīng)用白藜蘆醇可以抑制大鼠腦創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活； 2、通過免疫組化方法及分子生物學(xué)方法證實(shí)應(yīng)用白藜蘆醇可以抑制大鼠