白藜蘆醇對大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元自噬與炎癥調(diào)控的實驗研究.pdf

1、目的：本實驗應(yīng)用電子控制性腦皮質(zhì)撞擊損傷（eCCI）方法復(fù)制SD雄性大鼠TBI模型，給予白藜蘆醇干預(yù)，檢測藥物對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白Beclin1，LC3和P62以及神經(jīng)炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平的影響。研究腦創(chuàng)傷后其神經(jīng)保護的機制。
　　方法：成年雄性SD大鼠200只隨機分三組：一組大鼠麻醉后開顱，但不做任何處理，然后縫合，為假手術(shù)組（Sham group）；一組大鼠麻醉后開顱，用eCCI打擊儀打擊，為外傷

2、組（TBI group）；一組大鼠在麻醉前30分鐘給予白藜蘆醇，然后進行手術(shù)，為治療組（RV group）。采用eCCI方法復(fù)制TBI模型，傷后12 h、24 h、48 h3個時間點進行檢測：1使用 HE染色法顯示海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)；2蛋白質(zhì)印記法檢測自噬相關(guān)蛋白 LC3，Beclin1，P62和神經(jīng)炎癥因子 TNF-α，IL-1β的表達(dá)水平；3免疫熒光檢測 LC3與 NeuN的表達(dá)定位情況；4干濕比重法檢測腦組織水含量；5另取20只S

3、D大鼠TBI后在進行Morris水迷宮測試前預(yù)先適應(yīng)并訓(xùn)練游泳，并在傷后7，8，9，10天通過水迷宮實驗測試，測得其平均逃離潛伏期，進而評估外傷后空間學(xué)習(xí)和記憶能力情況。我們使用q檢驗對兩兩比較進行統(tǒng)計分析，并使用單因素方差分析對組間比較進行統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05時，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1 HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)的結(jié)果：Sham組腦組織無水腫，神經(jīng)元數(shù)量多，結(jié)構(gòu)正常、排列整齊，無損傷改變。TBI組神經(jīng)元呈現(xiàn)出損傷的表現(xiàn)，

4、細(xì)胞明顯腫脹，數(shù)量減少，排列紊亂，結(jié)構(gòu)變形；海馬區(qū)腦組織出現(xiàn)水腫、組織間隙變大，間質(zhì)充血，神經(jīng)元數(shù)量減少，核變形，出現(xiàn)神經(jīng)元變性及壞死。白藜蘆醇組較TBI組相比組織水腫較輕，排列整齊；海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對完整，數(shù)目略有增多，胞核固縮明顯恢復(fù)。2 LC3II的Western blot檢測結(jié)果：Sham組LC3II的蛋白有少量表達(dá)，在各時間點均無明顯變化；TBI組LC3II的蛋白表達(dá)量在傷后12 h快速升高，于24 h達(dá)高峰，持續(xù)至傷后48

5、 h，與Sham組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RV組的LC3II的蛋白含量在外傷12 h后緩慢升高，于24 h后開始下降，其峰值低于TBI組，傷后48 h的LC3II的蛋白含量仍較高，與TBI組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。3 Beclin1的 Western blot檢測結(jié)果：Sham組Beclin1的蛋白有少量表達(dá)，在各時間點均無明顯變化；TBI組Beclin1的蛋白表達(dá)量在傷后12 h開始升高，于24 h達(dá)高峰，持續(xù)

6、至傷后48 h，與Sham組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RV組的Beclin1的蛋白含量在外傷12 h后緩慢升高，于24 h后開始下降，其峰值低于TBI組，傷后48 h的Beclin1的蛋白含量仍較高，與TBI組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。4 P62的 Western blot檢測結(jié)果:Sham組P62的蛋白有較強的表達(dá)，表達(dá)量在各時間點無差異。TBI組P62的蛋白表達(dá)量與Sham組比較在傷后12 h快速降低（P＜0.0

7、5），24 h最低，雖然之后有所上調(diào)，但在創(chuàng)傷后48 h的表達(dá)依然低于Sham組（P＜0.05）。RV組的P62的蛋白表達(dá)量在傷后12 h緩慢下降，24 h后開始上升，但其最低值高于TBI組，傷后48 h的P62的蛋白含量仍較低。與TBI較比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。5 TNF-α的 Western blot檢測結(jié)果：Sham組TNF-α的蛋白表達(dá)量水平較低，在各時間點均無明顯變化；TBI組TNF-α的蛋白表達(dá)量在傷后12 h開始

8、升高，于24 h達(dá)高峰，持續(xù)至傷后48 h，與Sham組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RV組的TNF-α的蛋白含量在外傷12 h后緩慢升高，于24 h后開始下降，其峰值低于TBI組，傷后48 h的TNF-α的蛋白含量仍較高，與TBI組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。6 IL-1β的 Western blot檢測結(jié)果：Sham組IL-1β的蛋白有少量表達(dá)，在各時間點均無明顯變化；TBI組IL-1β的蛋白表達(dá)量在傷后12 h開始升

9、高，于24 h達(dá)高峰，持續(xù)至傷后48 h，與Sham組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RV組的IL-1β的蛋白含量在外傷12h后緩慢升高，于24 h后開始下降，其峰值低于TBI組，傷后48 h的IL-1β的蛋白含量仍較高，與TBI組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。7 LC3與 NeuN的免疫熒光檢測結(jié)果。圖中LC3存在于胞漿中，被紅色熒光所標(biāo)記，NeuN是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記，被綠色熒光所標(biāo)記，黃色為LC3與NeuN merge在

10、一起。8腦組織水含量：Sham組各時間點腦組織水含量未見差異；TBI組各時間點含水量均明顯高于Sham組（P<0.05）；RV組各時間點水含量較TBI組明顯減少（P<0.05）。9 Morris水迷宮結(jié)果：于TBI后第7-10天對各組大鼠進行水迷宮測試。TBI組平均潛伏期較Sham組均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RV組潛伏期較TBI組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：應(yīng)用eCCI方法成功建立了