大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬調節(jié)的分子機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是由外力導致腦組織嚴重受損的疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點，且患者多數(shù)是青壯年，幸存者大部分遺留有不同程度的神經(jīng)和心理方面的功能障礙，給家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。但是目前來講，TBI的治療手段比較有限，因此深入研究TBI后的生理病理機制改變、尋找新的有效治療靶點一直是TBI研究的熱點與難點。
　　 TBI后導致進一步腦損害發(fā)生的主要病理

2、機制是繼發(fā)性腦損傷（Secondary brain injury, SBI），繼發(fā)性腦損傷發(fā)生于受傷后數(shù)分鐘到數(shù)天甚至更長的時間內，它是以原發(fā)性損傷為基礎逐漸發(fā)展起來的病理改變，是造成TBI后神經(jīng)元損傷、乃至死亡的重要原因，因此對繼發(fā)性腦損傷的治療是改善TBI患者預后的關鍵。最近研究證明TBI后由氧自由基尤其超氧陰離子所引起的連鎖反應是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)。其中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine

3、 dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是由多個亞基組成的酶復合體，在氧化酶正常功能的維持及氧自由基的產(chǎn)生過程中起著重要作用。NADPH氧化酶參與TBI后繼發(fā)性腦損傷的機制還未完全闡明。在腦缺血-再灌注研究中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶在各種因素作用下活性增加產(chǎn)生過多的活性氧通過各種細胞內或細胞間的信號傳導途徑參與腦缺血后神經(jīng)元的死亡。自噬(aut ophagy)性細胞死亡作為神經(jīng)細胞死亡的一種新形式，近期越來越受到關

4、注，但是其在TBI中的作用及其信號轉導的調節(jié)機制方面研究仍然不足，其信號轉導通路在腦損傷后是否受到NADPH氧化酶的調節(jié)目前也不是很明確。
　　 本文擬利用改良的Marmarou方法復制大鼠彌漫性中度TBI模型，并應用NADPH氧化酶特異性抑制劑Apocynin、Akt特異性抑制劑LY294002進行預處理，探討NADPH氧化酶活性與其催化亞單位NOX2蛋白表達的變化以及其在繼發(fā)性腦損傷中的作用;同時明確NADPH氧化酶對海馬神

5、經(jīng)元自噬表達的影響與其可能的調節(jié)機制，以尋找TBI后引起神經(jīng)元自噬發(fā)生的信號通路上游中關鍵的調節(jié)靶點，為研究TBI后繼發(fā)性腦損害的發(fā)生機理與臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。本研究論文分共三部分進行闡述。
　　 第一部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶活性和其催化亞單位NOX2的表達變化及在繼發(fā)性腦損傷中的作用
　　 目的:檢測彌漫性中度TBI大鼠海馬CA1區(qū)NADPH氧化酶活性及其催化亞單位NOX2蛋白的表達變化，

6、明確NADPH氧化酶在繼發(fā)性腦損傷中的作用。
　　 方法:健康SD雄性大鼠240只數(shù)字隨機分組:
　　 ①假手術組(Sham group);
　　 ②腦創(chuàng)傷組(TBI group);
　　 ③腦創(chuàng)傷+溶劑組(DMSO group);
　　 ④腦創(chuàng)傷+Apocynin組(Apocynin group)。
　　 采用改良的Marmarou方法復制中度TBI模型，于TBI后6h、12h、24 h

7、、48 h、72 h等5個時間點對下列指標進行檢測:
　　 ①HE染色觀察腦組織CA1區(qū)病理形態(tài)學變化;
　　 ②免疫組化檢測海馬CA1區(qū)NOX2的蛋白表達、定位;
　　 ③Western-blot檢測海馬區(qū)NOX2的蛋白表達;
　　 ④光澤精比色法檢測海馬區(qū)NADPH氧化酶活性;
　　 ⑤干濕比重法測定腦組織水含量;
　　 ⑥另取40只SD大鼠于TBI后8、10天行Morris水迷宮測試

8、，檢測其空間學習記憶能力。
　　 應用Image Proplus 6.0和Gel-Doc軟件分析系統(tǒng)對實驗結果進行定量，所得數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，用SPSS15.0統(tǒng)計軟進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、HE染色觀察組織形態(tài)學變化:海馬CA1區(qū)Sham組組織形態(tài)結構正常，神經(jīng)

9、細胞數(shù)較量多，形態(tài)完整;TBI組和DMSO溶劑組神經(jīng)元胞體腫脹明顯，胞漿嗜色性染色減弱，核仁皺縮濃染明顯，細胞周圍存在較大間隙，出現(xiàn)神經(jīng)元變性壞死等;Apocynin治療組神經(jīng)元胞體腫脹和核仁濃縮較TBI組明顯減輕，神經(jīng)元周圍間隙相對較小。
　　 2、NOX2免疫組化檢測結果:NOX2在海馬CA1區(qū)主要定位于細胞的胞膜，Sham組偶可見陽性細胞，著色較淺淡;與Sham組相比，TBI后6h起NOX2陽性細胞開始增多，著色加深，免疫

10、反應性增強，24 h達高峰，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); DMSO組與TBI組NOX2表達組間無差異;Apocynin治療組NOX2陽性表達趨勢與TBI組和DMSO組相似，但免疫反應性明顯減弱（P＜0.05）。
　　 3、海馬區(qū)NOX2蛋白Western-blot檢測結果:Sham組NOX2的蛋白有少量表達，且在各時間點無明顯變化;TBI組與Sham組相比NOX2的蛋白表達量在傷后6h開始升高，峰值在TBI后24 h出

11、現(xiàn)，后開始下降，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＞0.05); DMSO組與TBI組的NOX2表達組間無明顯差異，Apocynin治療組各時間點NOX2蛋白表達趨勢與TBI和DMSO組相似，但表達量明顯降低（P＜0.05）。
　　 4、海馬區(qū)NADPH氧化酶活性結果檢測:在Sham組中NADPH氧化酶活性較低，不隨時間推移而改變;TBI組和DMSO組在TBI后6h起明顯升高，24 h達到高峰，后開始回落，到72 h仍然沒有降至正常水平，

12、各個時間點NADPH氧化酶的活性與Sham組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Apocynin治療組NADPH氧化酶活性變化趨勢同TBI組，與TBI和 DMSO組相比其活性明顯下降(P＜0.05)。
　　 5、TBI后腦組織水含量測定:TBI后6h、12h、24 h、48 h、72 h腦組織水含量百分比分別為77.23±0.82、78.51±0.92、80.62±0.79、80.75±1.06、80.92±0.87。DMSO組

13、各時間點含水量與TBI組相似，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但均明顯高于假手術組74.62士0.76(P＜0.05);Apocynin干預組各時間點水含量較TBI組明顯減少（P＜0.05）。
　　 6、學習記憶能力改變:使用Morris水迷宮測試檢測大鼠學習記憶能力改變。 TBI組和DMSO組傷后第8天及第10天搜索安全島潛伏期較Sham組均明顯延長，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Apocynin組傷后第8天及第10天搜

14、索安全島運動軌跡、潛伏期均較TBI和DMSO組明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　 小結:TBI后海馬CA1區(qū)NADPH氧化酶催化亞單位NOX2表達水平上調，NADPH氧化酶活性增加，加重TBI后繼發(fā)性腦損傷;抑制TBI后NADPH氧化酶的激活可以明顯減輕腦水腫，改善學習記憶功能障礙，具有神經(jīng)保護作用。
　　 第二部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬的影響
　　 目的:探討

15、TBI后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元是否發(fā)生自噬，并明確NADPH氧化酶是否對神經(jīng)元自噬的表達存在影響。
　　 方法:采用改良的Marmarou方法復制大鼠中度TBI模型。隨機分組:
　　 ①Sham組(n=45);
　　 ②TBI組(n=45);
　　 ③DMSO組(n=45);
　　 ④Apocynin組(n=45)。
　　 取傷后6h、12h、24 h、48 h、72 h共5個時間點對下列指標

16、進行檢測:
　　 ①免疫組化檢測海馬CA1區(qū)自噬標志性蛋白Beclin-1的表達、定位;
　　 ②Western-blot檢測海馬區(qū)自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Beclin-1的蛋白表達;
　　 ③熒光雙標檢測海馬CA1區(qū)LC3與神經(jīng)元特異性標記物(NeuN)的表達、定位。定量分析和統(tǒng)計方法同第一部分。
　　 結果:
　　 1、海馬CA1區(qū)Beclin-1免疫組化檢測結果:Beclin

17、-1主要定位于神經(jīng)元胞質，Sham組偶見陽性表達，著色淺淡，免疫反應性不隨時間推移而改變。與Sham組比較，TBI組傷后6h起B(yǎng)eclin-1陽性細胞開始明顯增多，且著色加深，免疫反應性增強，傷后24 h達高峰，后開始下降，DMSO組與TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); Apocynin治療組Beclin-1表達趨勢與TBI組相似，但陽性表達與免疫反應性明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、海馬Be

18、clin-1的Western blot檢測結果:Sham組Beclin-1蛋白表達較低，各時間點無變化;與Sham組比較，TBI組傷后6h起B(yǎng)eclin-1蛋白量逐漸增加，傷后24 h達高峰，后表達逐漸下降至傷后72 h仍未達正常水平，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); TBI組與DMSO組比較Beclin-1表達變化組間無差異(P＞0.05); Apocynin治療組Beclin-1蛋白表達時程變化與TBI組相似，但各時間點表達量

19、明顯減少(P＜0.05)。
　　 3、海馬CA1區(qū)LC3的Western blot檢測結果:Sham組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在各時間點無變化;與Sham組比較，傷后6h開始TBI組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值逐漸升高，24 h達峰值，后逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;TBI組與DMSO組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;Apocynin治療組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值變化趨勢與TBI組相似，但比值明顯變小，傷后6h

20、、12h、24 h、48 h和72 h差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、海馬CA1區(qū)LC3與神經(jīng)元特異性標記物(NeuN)熒光雙標檢測結果:激光共聚焦顯微鏡下可見LC3為TRITC標記的細胞核周紅色熒光，NeuN為FITC標記的綠色熒光。在TBI組中可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞胞漿中可見大量綠色和紅色熒光重疊呈黃色聚集，說明神經(jīng)元發(fā)生了自噬;Apocynin治療組中紅色熒光和綠色熒光重疊明顯減少，神經(jīng)元自噬表達受到抑

21、制。
　　 小結:TBI后6h起海馬CA1亞區(qū)神經(jīng)元即可檢測到自噬現(xiàn)象的發(fā)生，且自噬表達逐步增強，于TBI后24 h達峰值;使用Apocynin進行預處理可明顯減輕神經(jīng)元發(fā)生自噬的程度:結果表明TBI后NADPH氧化酶介導調控了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的自噬發(fā)生。
　　 第三部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬調節(jié)的分子機制研究
　　 目的:通過使用NADPH氧化酶與Akt特異性抑制劑Apoc

22、ynin和LY294002進行干預處理，明確TBI后Akt/mTOR信號通路是否參與了NADPH氧化酶介導調控的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的自噬發(fā)生。
　　 方法:將270只SD大鼠隨機分成6組:
　　 ①Sham組；
　　 ②Sham+LY294002組；
　　 ③TBI組；
　　 ④DMSO組；
　　 ⑤Apocynin組；
　　 ⑥Apocynin+LY294002組。
　　

23、 每組又分別劃分為傷后6h、12h、24 h、48 h、72 h等5個時間點。檢測：
　　 ①HE染色觀察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)改變;
　　 ②Western blot半定量檢測P-Aktser-473、 p-P70S6KThr-389、 Beclin-1、 LC3的蛋白表達;
　　 ③熒光顯微鏡檢測LC3、p-AktThr-389分別與神經(jīng)元特異性標記物(NeuN)雙標定位。
　　 結果分析和統(tǒng)計方法同前

24、。
　　 結果:
　　 1、HE染色觀察組織形態(tài)學改變:光鏡下Sham組和TBI組腦組織形態(tài)結構同前;Apocynin聯(lián)合LY294002治療組在TBI后24 h可見病理形態(tài)改變較TBI組明顯加重，神經(jīng)元胞體腫脹明顯，壞死，胞漿嗜色性染色減弱與核仁皺縮濃染更加明顯。
　　 2、海馬區(qū)p-Aktser-473的Western blot檢測結果:Sham組p-Aktser-473蛋白表達較低，在各時間點無變化，與Sh

25、am組比較，TBI組傷后6h起p-Aktser-473蛋白量顯著增高（P＜0.05），6 h-24 h表達逐漸下降，24 h后表達又緩慢增強呈雙峰狀，Apocynin組各時間點p-Aktser-473蛋白表達趨勢變化與TBI組相似，但表達量顯著增加，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、海馬區(qū)p-P70S6KThr-389的Western blot檢測結果:Sham組p-P70S6KThr-389蛋白表達較低，不隨時

26、間推移而改變;與Sham組相比， TBI組傷后6h起p-P70S6KThr-389蛋白量顯著增高(P＜0.05)，6 h-24 h表達逐漸下降，24 h后表達又緩慢增強呈雙高峰表達，Apocynin組各時間點p-P70S6KThr-389蛋白表達趨勢變化與TBI組相似，但表達量顯著增加。
　　 4、海馬區(qū)Beclin-1的Western blot檢測結果:Sham+LY294002組與Sham組相比Beclin-1蛋白表達相應時

27、間點無明顯差異。TBI組與Sham組比較，傷后6h起B(yǎng)eclin-1逐漸增加，傷后24 h達峰值，后逐漸下降;Apocynin治療組Beclin-1蛋白表達趨勢與TBI組相似，但表達量顯著減少，Apocynin+LY294002組與TBI組比較，相應時間點Beclin-1蛋白表達明顯增加，組間差異均有有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5、海馬區(qū)LC3的Western blot檢測結果:Sham+LY294002組與Sham組

28、相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值無明顯差異;與Sham組比較，TBI組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值于TBI后6h開始升高，于24 h達峰值，后表達逐漸下降;Apocynin組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值變化趨勢與TBI組相似，但比值明顯變小(P＜0.05);Apocynin+LY294002組與TBI組比較，各時間點LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯增加(P＜0.05)。
　　 6、LC3與海馬CA1區(qū)NeuN熒光雙標檢測結果:激光共聚焦顯微鏡下可見L

29、C3為TRITC標記的紅色熒光，NeuN為FITC標記的綠色熒光。TBI組中可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞胞漿中可見大量綠色和紅色熒光重疊呈黃色聚集，證明神經(jīng)元發(fā)生了自噬;Apocynin治療組中紅色熒光和綠色熒光重疊明顯減少，神經(jīng)元自噬程度減弱;Apocynin聯(lián)合LY294002治療組紅色熒光和綠色熒光重疊明顯增加，神經(jīng)元自噬程度增強。
　　 7、P-Aktser-473與海馬CA1區(qū)NeuN熒光雙標檢測結果:激光共聚焦顯微鏡下

30、可見p-Aktser-473為TRITC標記的紅色熒光，NeuN為FITC標記的綠色熒光。在TBI組中可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞胞漿中可見大量綠色和紅色熒光重疊呈黃色聚集;Apocynin治療組中紅色熒光和綠色熒光重疊明顯增加，說明Apocynin通過抑制NADPH氧化酶而上調了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-Aktset-473的表達。
　　 小結:大鼠發(fā)生彌漫性TBI后，NADPH氧化酶活性增加，抑制了氧化應激上調的Akt/mTOR信