白藜蘆醇與美滿霉素對LPS所致大鼠黒質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的保護作用研究.pdf

1、研究背景與目的：帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種常見于中老年人的進行性神經(jīng)退行性疾病，隨著社會人口老齡化，發(fā)病率逐漸增加。PD的病因及確切發(fā)病機制至今不明，因此尚缺乏有效的根治策略。目前臨床上應(yīng)用的治療方法主要是以左旋多巴替代治療為主的癥狀性治療，但這種治療措施只能緩解癥狀，卻不能阻止疾病進展，且隨著用藥時間延長，藥效逐漸下降，還常常出現(xiàn)嚴重的副作用，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來巨大的精神和經(jīng)濟

2、負擔。因此，人們熱切期待著開發(fā)出更有效的治療PD藥物。近年來隨著人們對PD研究的不斷深入，以小膠質(zhì)細胞激活為特征的神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，正常情況下它起到免疫監(jiān)視作用。但是在腦部外傷或者遇到免疫刺激時，小膠質(zhì)細胞易被激活，并且釋放多種毒性細胞因子，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-1β（interleukin-1β，IL-

3、1β），花生四烯酸代謝產(chǎn)物，一氧化氮和反應(yīng)性氧自由基等，最終導致神經(jīng)元變性死亡。因此抑制小膠質(zhì)細胞激活為主的炎癥反應(yīng)，或減少小膠質(zhì)細胞釋放的神經(jīng)毒性細胞因子，可以部分地防止DA能神經(jīng)元變性，阻止PD的進展。這是抗炎藥物研究成為近年P(guān)D研究熱點的原因之一。本研究通過黑質(zhì)內(nèi)注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）制作PD動物模型，應(yīng)用具有抗炎作用的中藥白藜蘆醇及美滿霉素對實驗動物進行干預，采用免疫組化方法及免疫印跡技術(shù)等觀

4、察二者對LPS所致大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的保護作用、對小膠質(zhì)細胞激活及NF-κB活性的影響。目的是觀察白藜蘆醇及美滿霉素對DA能神經(jīng)元的保護作用，并對其神經(jīng)保護機制進行探討，為開發(fā)新的PD治療藥物奠定實驗基礎(chǔ)。至今相關(guān)研究國內(nèi)外鮮見報道。 方法：取48只雄性SD大鼠，體重200-250克，隨機分成4組：（1）對照組：黑質(zhì)內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液（PBS）。（2）PD組：黑質(zhì)內(nèi)注射LPS，生理鹽水灌胃。（3）Res治療組：黑質(zhì)內(nèi)注射L

5、PS，Res灌胃。（4）MC治療組：黑質(zhì)內(nèi)注射LPS，MC灌胃。黑質(zhì)內(nèi)立體定向注射5ug LPS或PBS，Res、MC及PD組在注射LPS前3h開始灌胃，劑量分別為20mg/kg/d、45mg/kg/d，PD組灌等量生理鹽水，持續(xù)到注射后14d。實驗終點腹腔內(nèi)注射阿樸嗎啡（Apomorphine，APO）來觀察大鼠行為學變化，采用免疫組織化學染色法檢測大鼠中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）及NF-κB

6、的陽性細胞數(shù)，并觀察小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化；免疫印跡法檢測黑質(zhì)TH及NF-κB蛋白的表達。 結(jié)果：實驗各組大鼠在阿樸嗎啡注射后均可誘發(fā)向右側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為，對照組無任何行為變化。PD組大鼠30min平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為196.90±9.52，MC組及Res組30min平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為120.03±10.50、106.57±7.89，與PD組相比，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少（P<0.01）。對照組及實驗各組黑質(zhì)均檢測到數(shù)量不同的TH陽性神經(jīng)元。與對

7、照組相比，PD組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，甚至消失（P<0.01）。Res組及MC組黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與PD組相比明顯增多（P<0.01）。MC組與Res組組間比較，Res組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，差異顯著（P<0.05）。對照組黑質(zhì)OX-42陽性小膠質(zhì)細胞大部分呈分枝狀，細胞體較小，突觸細長。PD組黑質(zhì)OX-42陽性小膠質(zhì)細胞大部分呈圓形，突起少而短，甚至消失，呈“灌木樣”；少部分有短粗突觸，呈“阿米巴”狀。與PD組相比，Res

8、組和MC組呈激活狀態(tài)的OX-42陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少。對照組黑質(zhì)僅見少數(shù)NF-κB陽性細胞，PD組黑質(zhì)NF-κB陽性細胞增多（P<0.01）。與PD組相比，Res組和MC組NF-κB陽性細胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。MC組與Res組組間相比，Res組NF-κB陽性細胞數(shù)更少，差異顯著（P<0.05）。Western blot分析表明對照組大鼠黑質(zhì)TH蛋白大量表達，僅有微量NF-κB P65蛋白表達，PD組TH蛋白表達減少，NF-

9、κB P65蛋白表達明顯增高（P<0.01）。與PD組相比，Res組、MC組TH蛋白表達增加，NF-κB P65蛋白表達顯著下降（P<0.01）。MC組與Res組組間比較，Res組TH蛋白表達增加，NF-κB P65蛋白表達下降，差異顯著（P<0.05）。 結(jié)論：LPS可誘導大鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞激活、NF-κB表達增加、使TH陽性DA能神經(jīng)元數(shù)量減少，TH表達下降。中藥白藜蘆醇及第二代四環(huán)素類抗生素美滿霉素可抑制小膠質(zhì)細胞激活、抑