乙酰化白藜蘆醇對大鼠海水吸入型肺損傷的保護作用研究.pdf

1、研究背景:
　　淹溺是一個重大但時常被忽視的公共衛(wèi)生問題,據(jù)不完全統(tǒng)計,每年約有50萬人死于淹溺。肺臟是吸入海水后首先受到侵害的重要臟器,研究表明吸入海水所致肺損傷明顯比吸入淡水嚴重。海水吸入型肺損傷(SeawaterInhalationInducedAcuteLungInjury,SWI-ALI)主要表現(xiàn)為肺部炎癥反應和肺水腫,具體發(fā)生機制較為復雜,可以肯定的是損傷的嚴重程度取決于液體的吸入量和清潔程度。海水吸入型肺損傷病情發(fā)展

2、迅速,如未及時治療或處置不當易發(fā)展為海水吸入型呼吸窘迫綜合征(SeawaterInhalationInducedAcuteRespiratoryDistressSyndrome,SWI-ARDS)。近年來,對海水吸入型肺損傷發(fā)病機制和救治的研究日益增多,但是對其發(fā)病機制尚未形成統(tǒng)一認識,未能提出切實有效、有針對性的治療措施。
　　核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是一種幾乎存在于所有哺乳動物細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子,參與細胞增殖、分化、凋亡和癌

3、變等多種病理生理過程。通常細胞中NF-κB與IκB結合存在于細胞漿中;當受到LPS、TNF-α和IL-1等刺激時,IκB被迅速降解,游離狀態(tài)的NF-κB轉(zhuǎn)移入細胞核,與相應目的基因結合并促使其轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮相應的生物學功能。NF-κB調(diào)節(jié)多種效應分子的表達,介導組織損傷與修復;其中缺氧誘導因子1α(HIF-1α)和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)是其重要的下游調(diào)節(jié)因子,三者共同參與多種疾病的發(fā)生于發(fā)展。在此理論基礎上,NF-κB相關信號通路在

4、海水吸入型肺損傷中的作用成為本課題的研究重點。
　　白藜蘆醇(Resveratrol)是廣泛存在于多種植物體內(nèi)的多酚化合物,是一種植物抗毒素,具有多種生物活性,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤細胞增殖和抗細胞老化等;因此,近年來對白藜蘆醇的研究較為多見。然而,由于白藜蘆醇生物半衰期短和血藥濃度低等原因,其臨床應用始終面臨種種困難。乙?；邹继J醇是白藜蘆醇三個羥基被乙?；〈蟮漠a(chǎn)物,在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇發(fā)揮藥理活性,并且能夠增加白藜蘆醇在肺

5、部蓄積濃度同時延長生物半衰期,前期研究表明乙?；邹继J醇能夠通過抑制活性氧類(reactiveoxygenspecies,ROS)的生成降低γ-射線照射時小鼠的死亡率。在本研究中,我們通過體內(nèi)試驗觀察大鼠吸入海水后肺部損傷性變化及乙酰化白藜蘆醇的保護作用;在細胞實驗中,我們采用白藜蘆醇,乙?；邹继J醇的代謝產(chǎn)物,研究其保護作用的具體機制。
　　實驗目的:
　　(1)明確乙?；邹继J醇能否抑制炎癥反應和氧化損傷減輕海水吸入型肺

6、損傷;
　　(2)進一步探討乙?；邹继J醇抗炎、抗氧化的具體信號轉(zhuǎn)導機制,尤其是NF-κB、iNOS和HIF-1α等信號分子在其中的作用;
　　(3)細胞試驗驗證相關信號通路在海水吸入型肺損傷中的作用。
　　實驗方法:
　　實驗一:
　　健康雄性SD大鼠按照完全隨機的方法分為6組:A組:空白對照組;B組:海水吸入型肺損傷模型組;C組:乙?；邹继J醇低劑量(50mg/kg)組;D組:中劑量組(150mg/kg

7、);E組:高劑量組(450mg/kg)預處理組;和F組:PDTC預處理組(100mg/kg)。各預處理組從造模前7天開始每天灌胃相應藥物,最后一次灌胃90分鐘后造模,向?qū)嶒灤笫髿夤軆?nèi)滴注配方海水4ml/kg。造模4小時后放血處死取肺組織標本。采用HE染色的方法觀察各組大鼠肺組織結構損傷變化;通過ELISA的方法檢測肺組織中TNF-α和IL-1β的含量,分別采用硫代巴比妥酸(ThibabituricAcidTBA)法和黃嘌呤氧化酶法測定肺

8、組織中MDA含量和T-SOD活性,用WesternBlot的方法檢測NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達量。以評價乙?；邹继J醇對海水吸入后所致炎癥和氧化損傷的改善作用。
　　實驗二:
　　將處于指數(shù)生長期的A549細胞分為4組,A:正常培養(yǎng)組;B:海水刺激組;C:白藜蘆醇干預組;D:PDTC預處理組。C組和D組在分別加入200μmol/L白藜蘆醇和PDTC30分鐘后進行海水刺激。同時向B、C和D組加入含有25％配方海水

9、的培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)4小時后棄去培養(yǎng)基進行免疫熒光染色操作,檢測細胞中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達量。
　　實驗結果:
　　實驗一:
　　與空白對照組相比,大鼠吸入海水后肺組織結構受到破壞,肺泡壁增厚并伴有局部塌陷;肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)可見大量水腫液滲出和炎細胞浸潤;肺組織內(nèi)代表損傷效應的TNF-α、IL-1β、MDA和NO等表達量增加(P<0.05),而代表抗損傷效應的T-SOD活性降低(P<0.05);同時,

10、海水吸入能夠?qū)е翹F-κB、HIF-1α和iNOS的表達量增高(P<0.05)。然而,乙?；邹继J醇預處理組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、MDA和NO表達量相對降低(P<0.05),T-SOD表達量增高(P<0.05),且高劑量組效果最為明顯(P<0.01);同時,乙?；邹继J醇降低肺組織中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達量(P<0.05),且干預效果與PDTC無明顯差異(P>0.05)。
　　實驗二:
　　與

11、正常培養(yǎng)的細胞相比,海水刺激后A549細胞中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達量明顯增高,而乙酰化白藜蘆醇體內(nèi)代謝產(chǎn)物白藜蘆醇預處理后NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達量顯著降低,與PDTC效果無明顯差異。
　　結論:
　　NF-κB及其下游的信號分子HIF-1α和iNOS構成的信號通路參與海水吸入型肺損傷的發(fā)生與發(fā)展;乙?；邹继J醇能夠通過干預此信號通路的表達,抑制下游炎癥因子等的表達減輕海水吸入所致的肺部炎癥