白藜蘆醇對(duì)酒精性周圍神經(jīng)損傷的保護(hù)作用.pdf

1、臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，飲酒不僅可以導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，而且還會(huì)引起周圍神經(jīng)病變。長(zhǎng)期以來(lái)，酒精對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響作用的研究較為深入，而對(duì)酒精性周圍神經(jīng)病變的研究不夠深入，其神經(jīng)病理作用機(jī)制目前仍不清楚。最近研究結(jié)果表明，酒精導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡與氧化應(yīng)激反應(yīng)增加和氧化酶的誘導(dǎo)相關(guān)。
　　 長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致酒精性周圍神經(jīng)病變(alcoholicperipheralneuropathy,APN)。APN是最常見(jiàn)的多發(fā)性周圍神經(jīng)病

2、變之一。APN初期和主要癥狀為足部的疼痛，部分疼痛伴有燒灼感。部分患者亦可表現(xiàn)為手、小腿和足部的麻木或感覺(jué)缺失。APN的病理變化主要表現(xiàn)為軸突的病變，伴有節(jié)段性的脫髓鞘和髓鞘再生以及神經(jīng)纖維的減少。雖然具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但目前研究認(rèn)為APN與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的自由基對(duì)神經(jīng)的損傷、酒精對(duì)神經(jīng)的直接毒性作用和長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。
　　 施萬(wàn)細(xì)胞(Schwanncells，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，對(duì)周圍神經(jīng)的

3、發(fā)育、功能和再生具有重要作用。SCs在多種炎癥性、代謝性和遺傳性多發(fā)神經(jīng)病變中也有著重要作用。在許多生理和病理狀態(tài)下，尤其是在神經(jīng)損傷后，SCs可以通過(guò)表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nervegrowthfactor,NGF）等多種神經(jīng)營(yíng)

4、養(yǎng)因子對(duì)軸突提供營(yíng)養(yǎng)支持。SCs分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、預(yù)防神經(jīng)元凋亡具有重要作用。然而，在酒精處理的培養(yǎng)的SCs中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的變化尚不清楚。
　　 白藜蘆醇（resveratrol，Res）是存在于紅酒、葡萄、藍(lán)莓、花生等多種植物中的多醇化合物，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，并顯示出多種保護(hù)和治療功效。在Neuro2a細(xì)胞，Res能夠激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AM

5、PK)并促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)。Res能夠激活沉默信息調(diào)節(jié)器T1(silencinginformationregulatorT1，SIRT1)，可能對(duì)以軸突病變和神經(jīng)退行性變?yōu)樘卣鞯募膊【哂兄委熥饔?。Res能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)能力，對(duì)某些病理改變所致的背根神經(jīng)節(jié)（dorsalrootganglia，DRG）神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有修復(fù)作用。
　　 為了進(jìn)一步深入研究APN的病理發(fā)生機(jī)制，以及如何阻止APN的進(jìn)程和研發(fā)APN的新的治療手

6、段，本課題利用體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元和SCs、以及APN大鼠動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)多個(gè)分子生物學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)的分析，以及動(dòng)物的行為學(xué)觀察，進(jìn)一步探討APN的病理發(fā)生機(jī)制及Res對(duì)APN的治療作用。
　　 第一部分白藜蘆醇對(duì)酒精損傷的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 在發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)嵴區(qū)的細(xì)胞遷移形成DRG。全胚胎培養(yǎng)研究證明酒精可導(dǎo)致神經(jīng)嵴區(qū)的細(xì)胞減少。酒精還可導(dǎo)致培養(yǎng)的孕14d胚胎DRG神經(jīng)于細(xì)胞凋亡增加?？寡趸委煂?duì)酒

7、精誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，這也表明氧化應(yīng)激參與酒精導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。但是，尚不清楚抗氧化劑能否有效減少在發(fā)育過(guò)程中酒精誘導(dǎo)的神經(jīng)元減少。由于酒精對(duì)DRG神經(jīng)元的損傷目前尚無(wú)有效的治療方法，抗氧化劑有可能減輕酒精導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。本課題利用體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，研究體外環(huán)境中Res對(duì)酒精損傷的DRG神經(jīng)元的保護(hù)作用?；谝陨涎芯勘尘埃菊n題實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:
　　 取第15d的胚胎大鼠DRG進(jìn)行器官型培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。將酒精、Re

8、s、化合物C(CompoundC，CC)以及尼克酰胺(nicotinamide，NCA)分別加入不同實(shí)驗(yàn)組DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基內(nèi)。用微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associatedprotein2，MAP2)標(biāo)記神經(jīng)元。計(jì)數(shù)由器官型培養(yǎng)的DRG組織塊中生長(zhǎng)出的神經(jīng)纖維束和遷移出的神經(jīng)元的數(shù)目。使用水溶性四唑鹽-1(watersolubletetrazoliumsalt-1，WST-1)的方法檢測(cè)DRG神經(jīng)元的活性。使用Hoec

9、hst33342和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyl-transferase-mediateddeoxyuridinetriphosphatenick-end-labeling，TUNEL）染色技術(shù)觀察神經(jīng)元的凋亡。使用熒光探針2'，7'-二氯雙氫熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,DCFH-DA)檢測(cè)活性

10、氧的含量。檢測(cè)神經(jīng)元中丙二醛(malondialdehyde，MDA)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)，亞硝酸鹽和過(guò)氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)的水平來(lái)分析氧化應(yīng)激的程度。結(jié)果顯示:
　　 (1)Res可促進(jìn)酒精損傷的器官型培養(yǎng)的DRG組織塊神經(jīng)纖維束的生長(zhǎng)和單個(gè)神經(jīng)元向周圍的遷移。AMPK抑制劑CC和SIRT1抑制劑NCA可以抑制Res的作用。
　　 (2)酒精孵育可降低分

11、散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元的活性，給予Res可提高酒精損傷的DRG神經(jīng)元活性。AMPK抑制劑CC和SIRT1抑制劑NCA可以抑制Res的作用。
　　 (3)酒精孵育可誘發(fā)分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元凋亡，Res可改善酒精誘發(fā)的DRG神經(jīng)元凋亡。AMPK抑制劑CC和SIRT1抑制劑NCA可以阻斷Res的抗凋亡作用。
　　 (4)酒精孵育可增強(qiáng)分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，應(yīng)用Res可抑制酒精所致的氧化應(yīng)激，降低MDA和亞硝酸鹽的水

12、平，增加GSH的含量和SOD的活性。
　　 以上結(jié)果表明，Res對(duì)酒精損傷的器官型培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng)和再生具有促進(jìn)作用;Res可增強(qiáng)酒精損傷的分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元的活性;Res可改善酒精損傷所致的DRG神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激;Res的神經(jīng)保護(hù)作用與其對(duì)AMPK和SIRT1的激活有關(guān)，也與其抗氧化作用有關(guān)。因此，增強(qiáng)AMPK和SIRT1的活性有可能成為酒精對(duì)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元損傷的一種新的治療方法，Res對(duì)DRG神經(jīng)元的保護(hù)作用

13、很可能使Res成為通過(guò)這一途徑治療酒精所致感覺(jué)神經(jīng)元損傷的一個(gè)重要候選因子。
　　 第二部分白藜蘆醇對(duì)酒精損傷的施萬(wàn)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 SCs對(duì)DRG神經(jīng)元正常形態(tài)和功能的維持具有重要的作用，酒精所致的DRG神經(jīng)元損傷，很可能不但直接作用于神經(jīng)元，也可能對(duì)SCs造成損傷從而間接影響DRG神經(jīng)元功能的發(fā)揮。有研究顯示，酒精可抑制培養(yǎng)的SCs增殖和髓鞘的形成，孕期和哺乳期長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞BDNF和NGF表達(dá)的改變

14、，可能會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞成活、生長(zhǎng)、分化相關(guān)的信號(hào)通路，增加腦發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的死亡。然而，酒精對(duì)SCs的損傷程度及Res是否對(duì)酒精損傷的SCs具有保護(hù)作用目前仍不清楚。因此，本課題設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)，研究Res對(duì)酒精損傷的SCs細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 取新生大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)進(jìn)行SCs培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞分為6組:Res+酒精組;Res+CC+酒精組;Res+NCA+酒精組;Res+CC+NCA+酒精組;酒精組;對(duì)照組。用WST-

15、1分析法檢測(cè)Res對(duì)酒精引起的SCs細(xì)胞增殖和毒性的影響，用Hoechst33342和TUNEL染色技術(shù)觀察SCs細(xì)胞的凋亡，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BDNF、GDNF和NGFmRNA表達(dá)的變化，用Westernblot技術(shù)檢測(cè)BDNF、GDNF和NGF蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示:
　　 (1)酒精可降低SCs細(xì)胞的活性，Res可改善酒精損傷的SCs細(xì)胞的活性。AMPK抑制劑CC和SIRT1抑制劑NCA可以阻斷Res的作用。<

16、br>　　 (2)酒精孵育可增加SCs細(xì)胞的凋亡，Res可抑制酒精引起的細(xì)胞凋亡。AMPK抑制劑CC和SIRT1抑制劑NCA可以阻斷Res的抗凋亡作用。
　　 (3)酒精孵育可促進(jìn)SCs細(xì)胞NGFmRNA的表達(dá)，而對(duì)BDNFmRNA和GDNFmRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響作用;Res孵育可促進(jìn)SCs細(xì)胞BDNFmRNA和GDNFmRNA的表達(dá)，而對(duì)NGFmRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響作用。
　　 (4)酒精孵育可促進(jìn)SCs細(xì)胞NG

17、F、BDNF和GDNF蛋白的表達(dá)，而Res則可促進(jìn)BDNF和GDNF的表達(dá)，對(duì)NGF的表達(dá)反而具有抑制作用。
　　 以上結(jié)果表明，Res對(duì)酒精損傷的SCs細(xì)胞具有保護(hù)作用，Res很可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)而減少細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。Res對(duì)不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)具有不同的調(diào)節(jié)作用，這表明Res對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是復(fù)雜的。酒精孵育對(duì)SCs細(xì)胞不同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)產(chǎn)生不同的影響，這表明SCs細(xì)胞對(duì)所用酒精

18、劑量的反應(yīng)性，很可能是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制。酒精對(duì)SCs細(xì)胞的毒性作用機(jī)制及Res對(duì)SCs細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探討。
　　 第三部分白藜蘆醇對(duì)大鼠酒精性周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用
　　 氧化應(yīng)激是導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變出現(xiàn)神經(jīng)痛的重要因素之一。細(xì)胞因子可直接與傷害感受器作用并引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏。Res可通過(guò)清除ROS并作用于氧化還原調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。促炎癥細(xì)胞因子可介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和周圍神經(jīng)病理性疼

19、痛，長(zhǎng)期飲用大量酒精所致的神經(jīng)病理性疼痛是否與促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)以及Res對(duì)APN的治療作用尚需要進(jìn)一步探討。
　　 本課題利用酒精誘發(fā)的APN疼痛的動(dòng)物模型，通過(guò)檢測(cè)大鼠的痛覺(jué)行為學(xué)改變，觀察坐骨神經(jīng)光鏡水平的形態(tài)學(xué)和電鏡水平的超微結(jié)構(gòu)改變，以及檢測(cè)坐骨神經(jīng)內(nèi)MDA、GSH、亞硝酸鹽、SOD、腫瘤壞死因子-α(tumornectosisfactor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)

20、水平的變化，綜合分析酒精所致APN的病理發(fā)生機(jī)制及Res對(duì)酒精誘發(fā)的APN的治療作用。結(jié)果顯示:
　　 (1)大鼠經(jīng)酒精灌胃6w后即可出現(xiàn)觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏，至第12w，觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏更加明顯。
　　 (2)對(duì)于酒精誘發(fā)的APN疼痛大鼠，應(yīng)用Res后可緩解酒精所致的觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏。
　　 (3)給APN大鼠應(yīng)用Res后，坐骨神經(jīng)光鏡水平的形態(tài)學(xué)和電鏡水平的超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯改善。<

21、br>　　 (4)酒精誘發(fā)的APN大鼠，坐骨神經(jīng)組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，應(yīng)用Res可抑制酒精誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 (5)酒精可引起坐骨神經(jīng)組織內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子的水平升高，應(yīng)用Res可抑制這些促炎癥細(xì)胞因子水平的上升。
　　 以上結(jié)果表明，給大鼠長(zhǎng)期飲用酒精可對(duì)周圍神經(jīng)組織產(chǎn)生明顯的損傷作用，并導(dǎo)致動(dòng)物的痛覺(jué)行為學(xué)發(fā)生改變。酒精對(duì)周圍神經(jīng)組織的損傷作用是多方面的，不僅直接引起神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的改變，而且還增強(qiáng)氧化應(yīng)激反