OA對(duì)酒精性氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　酒精性相關(guān)疾病是一類由酒精代謝誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生代謝紊亂性疾病。酒精濫用日益成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。酒精對(duì)機(jī)體造成的損傷作用涉及多種病理機(jī)制。隨著研究的日益深入，酒精濫用引起氧化損傷作用得到廣泛認(rèn)同和重視，認(rèn)為ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷是酒精性相關(guān)疾病的最主要致病因素。研究進(jìn)展表明，酒精性相關(guān)疾病的預(yù)防和治療還缺乏相應(yīng)的藥物和手段，抗氧化劑被認(rèn)為是預(yù)防和治療酒精性相關(guān)疾病具有良好應(yīng)用前景的藥物。
　　齊墩果酸（

2、Oleanolicacid，OA）是一種來源于植物的天然三萜系化合物，具有很多重要的生物藥理活性。富含OA中藥如龍膽科植物青葉膽、木樨科植物女貞子、五加科植物楤木等在中醫(yī)應(yīng)用上歷史悠久，現(xiàn)已經(jīng)作為處方藥主要用來肝炎類疾病的輔助治療。研究發(fā)現(xiàn)OA具有一定程度的抗氧化功能，但是OA由于化學(xué)結(jié)構(gòu)原因，其生物利用度低，限制了在臨床上的應(yīng)用。由于在酒精中溶解度較好，因此，將OA溶解于酒精后可能減輕酒精大量攝入導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。闡明齊墩果酸的抗氧

3、化保護(hù)作用相關(guān)機(jī)制，研發(fā)酒精類保健產(chǎn)品，對(duì)減輕酒精類相關(guān)疾病的發(fā)病過程以及減少酒精濫用導(dǎo)致的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等都具有重要意義。
　　【目的】
　　(1)研究OA對(duì)酒精性氧化損傷的保護(hù)作用。
　　(2)探討OA在酒精性氧化損傷中發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　【方法】
　　(1)細(xì)胞模型：通過建立酒精性肝細(xì)胞氧化損傷模型，評(píng)價(jià)OA在酒精性損傷模型中的抗氧化活性作用和保護(hù)效應(yīng)。觀察了不同濃度不同時(shí)間OA作用QZG細(xì)胞

4、對(duì)Nrf-2等相關(guān)抗氧化酶蛋白表達(dá)的影響。還觀察了5、10、15μM的OA干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖活性的影響，同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞勻漿液內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，如SOD活性、MDA、GSH、GSSG和T-SH含量。測(cè)定了OA干預(yù)后對(duì)Nrf-2、SOD1、HO-1、Gpx的蛋白表達(dá)的改變。此外我們還觀察了OA在體外DPPH、O2-和-OH三種自由基化學(xué)發(fā)光模型中的抑制作用。
　　(2)動(dòng)物模型：通過4g/kg/day酒精灌胃大鼠30天誘導(dǎo)酒精

5、性大鼠氧化損傷模型，同時(shí)給以10mg/kg/day和20mg/kg/day兩種劑量的OA干預(yù)，取血清、肝、肌肉、脂肪勻漿，提取肝臟線粒體，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化和血糖改變，觀察了肝體比的改變，轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST活性和乳酸脫氫酶學(xué)指標(biāo)，血脂指標(biāo)和線粒體活性和腫脹度改變，血清等組織器官內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）含量變化，同時(shí)還觀察了血清、肝、脂肪和肌肉組織的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，如MDA、GSH、GSSG和T-SH含量，CAT、SOD、Gpx

6、、T-AOC活性。提取肝臟總蛋白，測(cè)定了Nrf-2、SOD-1、GR、HO-1蛋白表達(dá)水平。提取肌肉總蛋白，測(cè)定了Nrf-2蛋白表達(dá)水平。同時(shí)提取肝臟組織的總RNA，測(cè)定了Nrf-2基因表達(dá)水平。做肝臟和胃臟病理切片，H&E染色。系統(tǒng)觀察了酒精性肝損傷模型中的氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)性，以及抗氧化酶鏈的變化，重點(diǎn)研究了OA的抗氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　成功構(gòu)建了酒精干預(yù)QZG細(xì)胞的氧化損傷模型，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確

7、定了200mM的EtOH作用6h作為創(chuàng)建QZG細(xì)胞酒精性氧化損傷模型的處理方法。同時(shí)驗(yàn)證了OA在體外DPPH、O2-和-OH三種化學(xué)發(fā)光模型中的抑制作用，結(jié)果表明OA直接清除自由基的能力不強(qiáng)。OA作用QZG細(xì)胞24h濃度在15.625μM以下時(shí)對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響，表明對(duì)細(xì)胞未產(chǎn)生明顯毒作用。我們還發(fā)現(xiàn)5、10、15μMOA作用24h能顯著提高Nrf-2蛋白表達(dá)，10μMOA作用不同時(shí)間能顯著誘導(dǎo)Nrf-2、HO-1、CAT、PRX-1

8、蛋白表達(dá)，在24h內(nèi)表達(dá)量隨時(shí)間延長而增加。15μMOA作用能顯著抑制EtOH誘導(dǎo)的QZG細(xì)胞增殖活力損傷，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異（P<0.05）。OA對(duì)EtOH誘導(dǎo)的QZG細(xì)胞氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響結(jié)果表明結(jié)果表明200mMEtOH作用6h能誘發(fā)顯著的活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)，表現(xiàn)為SOD活性明顯降低、MDA含量升高，GSH含量降低、GSH/GSSH比值降低。給予不同劑量OA保護(hù)性干預(yù)后，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯降低，表現(xiàn)為MDA水平降低，抗

9、氧化酶活性增強(qiáng)，GSH含量增高，同時(shí)GSH/GSSG比值也顯著升高。蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5、10、15μMOA干預(yù)后，能明顯升高Nrf-2、SOD1、HO-1、Gpx的蛋白表達(dá)水平，與陽性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　在酒精誘導(dǎo)氧化損傷的動(dòng)物模型中，酒精灌胃后導(dǎo)致動(dòng)物體重減輕明顯，OA給藥對(duì)酒精導(dǎo)致的大鼠體重降低無明顯的改善作用，各組動(dòng)物血糖無明顯變化，但OA干預(yù)后顯著改善了陽性對(duì)照組肝體比的增加，減輕了肝臟的脂肪變病理改

10、變。給予10mg/kg/day和20mg/kg/day的OA后，血清ALT和AST活力值顯著降低，表明OA給藥后能顯著保護(hù)酒精導(dǎo)致的肝功能受損。兩種劑量的OA后明顯地改善了總膽固醇和低密度脂蛋白水平的增高趨勢(shì)，低劑量OA顯著降低了甘油三酯的水平，OA顯著降低了高密度脂蛋白的水平，機(jī)制待闡明。OA給藥后除對(duì)脂肪組織AGEs有一定程度的抑制作用外，其余如血清、肝臟和肌肉組織未發(fā)現(xiàn)明顯地改變。OA有助于維持線粒體谷胱甘肽氧化還原平衡，明顯改善

11、了酒精誘導(dǎo)的線粒體的活力值減少，并減輕了線粒體的腫脹程度。在血清和肝臟勻漿測(cè)定氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)結(jié)果表明，酒精作用可以導(dǎo)致血清和肝臟SOD和CAT活性下降，OA可提高以上兩種抗氧化酶活性。陽性對(duì)照組的血清Gpx活性與陰性對(duì)照組相比無顯著變化，OA后也未能改變其活性，陽性對(duì)照組肝勻漿Gpx活性無顯著變化，但給予OA后，Gpx活性反而明顯降低。陽性對(duì)照組血清T-AOC值上升，給藥后該趨勢(shì)減輕，肝臟內(nèi)T-AOC的變化趨勢(shì)同血清結(jié)果相反，OA干預(yù)

12、后肝臟總抗氧化力水平明顯增高。陽性對(duì)照組的血清和肝勻漿GSH含量降低、GSSG含量增加，在OA干預(yù)下，GSH顯著增高，GSH/GSSG比值顯著增高，這表明OA能通過恢復(fù)GSH系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。T-SH結(jié)果表明酒OA后能顯著保護(hù)酒精對(duì)巰基的耗竭作用。血清中MDA含量陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比無顯著改變，OA干預(yù)后MDA含量降低。肝勻漿MDA含量陽性對(duì)照組明顯增高，OA干預(yù)后明顯降低。陽性對(duì)照組肝臟Nrf-2、HO-1、GR、SOD-1等抗

13、氧化蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，肌肉Nrf-2也顯著下調(diào)，OA干預(yù)后顯著上調(diào)了上述蛋白的表達(dá)，同時(shí)還上調(diào)了肝臟Nrf-2的基因表達(dá)。組織病理學(xué)結(jié)果表明，OA給藥都顯著減輕了酒精誘導(dǎo)的胃臟和肝臟組織病理損傷。
　　【結(jié)論】
　　成功構(gòu)建了酒精損傷性QZG細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，系統(tǒng)研究了酒精性氧化損傷機(jī)制，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在酒精性氧化損傷的細(xì)胞和動(dòng)物模型中占有突出重要的地位，主要表現(xiàn)為自由基誘導(dǎo)的氧化損傷代謝產(chǎn)物增加，以Nrf2為核心的抗氧化酶

14、鏈表達(dá)、活性異常，抗氧化防御系統(tǒng)功能降低；肝臟慢性氧化損傷與脂代謝異常具有密切相關(guān)性；利用體外抗氧化劑篩選技術(shù)模型，測(cè)定了具有保肝作用的單體化學(xué)藥物OA的抗氧化反應(yīng)能力，顯示OA體外直接抗氧化作用相對(duì)較弱，可能與其明顯的脂溶解性有關(guān)；但是，給酒精性肝損傷細(xì)胞和動(dòng)物模型施加不同劑量的OA，則表現(xiàn)為明顯的抗氧化作用；進(jìn)一步研究表明，OA具有活化Nrf2為核心的抗氧化酶鏈作用，進(jìn)而啟動(dòng)機(jī)體整體的抗氧化防御系統(tǒng)功能，有效抑制酒精引起的肝臟氧化應(yīng)

15、激損傷，可能是保護(hù)肝臟防止損傷的重要機(jī)制之一。
　　本研究結(jié)果提示：OA直接清除自由基的作用較弱，但在酒精誘導(dǎo)的氧化損傷的體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型中都發(fā)揮了良好的抗氧化保護(hù)作用。OA可能通過誘導(dǎo)Nrf-2相關(guān)抗氧化酶表達(dá)，保護(hù)谷胱甘肽氧化還原平衡，提高機(jī)體抗氧化酶活性，保護(hù)線粒體功能，減輕脂代謝紊亂發(fā)揮其抗氧化作用。本研究結(jié)果充分說明OA在酒精性肝損傷相關(guān)疾病中具有顯著的研究、開發(fā)、應(yīng)用前景。本研究為更深一步研究OA在酒精性相關(guān)