OA對酒精性氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、【背景】
　　酒精性相關疾病是一類由酒精代謝誘導機體發(fā)生代謝紊亂性疾病。酒精濫用日益成為現(xiàn)代社會嚴重的公共衛(wèi)生問題。酒精對機體造成的損傷作用涉及多種病理機制。隨著研究的日益深入，酒精濫用引起氧化損傷作用得到廣泛認同和重視，認為ROS介導的氧化應激損傷是酒精性相關疾病的最主要致病因素。研究進展表明，酒精性相關疾病的預防和治療還缺乏相應的藥物和手段，抗氧化劑被認為是預防和治療酒精性相關疾病具有良好應用前景的藥物。
　　齊墩果酸（

2、Oleanolicacid，OA）是一種來源于植物的天然三萜系化合物，具有很多重要的生物藥理活性。富含OA中藥如龍膽科植物青葉膽、木樨科植物女貞子、五加科植物楤木等在中醫(yī)應用上歷史悠久，現(xiàn)已經(jīng)作為處方藥主要用來肝炎類疾病的輔助治療。研究發(fā)現(xiàn)OA具有一定程度的抗氧化功能，但是OA由于化學結構原因，其生物利用度低，限制了在臨床上的應用。由于在酒精中溶解度較好，因此，將OA溶解于酒精后可能減輕酒精大量攝入導致的氧化應激損傷。闡明齊墩果酸的抗氧

3、化保護作用相關機制，研發(fā)酒精類保健產(chǎn)品，對減輕酒精類相關疾病的發(fā)病過程以及減少酒精濫用導致的衛(wèi)生經(jīng)濟負擔等都具有重要意義。
　　【目的】
　　(1)研究OA對酒精性氧化損傷的保護作用。
　　(2)探討OA在酒精性氧化損傷中發(fā)揮保護作用的相關機制。
　　【方法】
　　(1)細胞模型：通過建立酒精性肝細胞氧化損傷模型，評價OA在酒精性損傷模型中的抗氧化活性作用和保護效應。觀察了不同濃度不同時間OA作用QZG細胞

4、對Nrf-2等相關抗氧化酶蛋白表達的影響。還觀察了5、10、15μM的OA干預對酒精誘導肝細胞增殖活性的影響，同時檢測了細胞勻漿液內(nèi)氧化應激相關指標，如SOD活性、MDA、GSH、GSSG和T-SH含量。測定了OA干預后對Nrf-2、SOD1、HO-1、Gpx的蛋白表達的改變。此外我們還觀察了OA在體外DPPH、O2-和-OH三種自由基化學發(fā)光模型中的抑制作用。
　　(2)動物模型：通過4g/kg/day酒精灌胃大鼠30天誘導酒精

5、性大鼠氧化損傷模型，同時給以10mg/kg/day和20mg/kg/day兩種劑量的OA干預，取血清、肝、肌肉、脂肪勻漿，提取肝臟線粒體，測定實驗動物體重變化和血糖改變，觀察了肝體比的改變，轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST活性和乳酸脫氫酶學指標，血脂指標和線粒體活性和腫脹度改變，血清等組織器官內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）含量變化，同時還觀察了血清、肝、脂肪和肌肉組織的氧化應激相關指標，如MDA、GSH、GSSG和T-SH含量，CAT、SOD、Gpx

6、、T-AOC活性。提取肝臟總蛋白，測定了Nrf-2、SOD-1、GR、HO-1蛋白表達水平。提取肌肉總蛋白，測定了Nrf-2蛋白表達水平。同時提取肝臟組織的總RNA，測定了Nrf-2基因表達水平。做肝臟和胃臟病理切片，H&E染色。系統(tǒng)觀察了酒精性肝損傷模型中的氧化應激損傷反應性，以及抗氧化酶鏈的變化，重點研究了OA的抗氧化損傷的保護作用機制。
　　【結果】
　　成功構建了酒精干預QZG細胞的氧化損傷模型，同時結合文獻報道，確

7、定了200mM的EtOH作用6h作為創(chuàng)建QZG細胞酒精性氧化損傷模型的處理方法。同時驗證了OA在體外DPPH、O2-和-OH三種化學發(fā)光模型中的抑制作用，結果表明OA直接清除自由基的能力不強。OA作用QZG細胞24h濃度在15.625μM以下時對細胞活力無顯著影響，表明對細胞未產(chǎn)生明顯毒作用。我們還發(fā)現(xiàn)5、10、15μMOA作用24h能顯著提高Nrf-2蛋白表達，10μMOA作用不同時間能顯著誘導Nrf-2、HO-1、CAT、PRX-1

8、蛋白表達，在24h內(nèi)表達量隨時間延長而增加。15μMOA作用能顯著抑制EtOH誘導的QZG細胞增殖活力損傷，統(tǒng)計學上有差異（P<0.05）。OA對EtOH誘導的QZG細胞氧化損傷相關指標的影響結果表明結果表明200mMEtOH作用6h能誘發(fā)顯著的活性氧介導的氧化應激損傷反應，表現(xiàn)為SOD活性明顯降低、MDA含量升高，GSH含量降低、GSH/GSSH比值降低。給予不同劑量OA保護性干預后，細胞氧化應激水平明顯降低，表現(xiàn)為MDA水平降低，抗

9、氧化酶活性增強，GSH含量增高，同時GSH/GSSG比值也顯著升高。蛋白表達水平實驗結果表明，5、10、15μMOA干預后，能明顯升高Nrf-2、SOD1、HO-1、Gpx的蛋白表達水平，與陽性對照組相比均有統(tǒng)計學意義。
　　在酒精誘導氧化損傷的動物模型中，酒精灌胃后導致動物體重減輕明顯，OA給藥對酒精導致的大鼠體重降低無明顯的改善作用，各組動物血糖無明顯變化，但OA干預后顯著改善了陽性對照組肝體比的增加，減輕了肝臟的脂肪變病理改

10、變。給予10mg/kg/day和20mg/kg/day的OA后，血清ALT和AST活力值顯著降低，表明OA給藥后能顯著保護酒精導致的肝功能受損。兩種劑量的OA后明顯地改善了總膽固醇和低密度脂蛋白水平的增高趨勢，低劑量OA顯著降低了甘油三酯的水平，OA顯著降低了高密度脂蛋白的水平，機制待闡明。OA給藥后除對脂肪組織AGEs有一定程度的抑制作用外，其余如血清、肝臟和肌肉組織未發(fā)現(xiàn)明顯地改變。OA有助于維持線粒體谷胱甘肽氧化還原平衡，明顯改善

11、了酒精誘導的線粒體的活力值減少，并減輕了線粒體的腫脹程度。在血清和肝臟勻漿測定氧化應激損傷指標結果表明，酒精作用可以導致血清和肝臟SOD和CAT活性下降，OA可提高以上兩種抗氧化酶活性。陽性對照組的血清Gpx活性與陰性對照組相比無顯著變化，OA后也未能改變其活性，陽性對照組肝勻漿Gpx活性無顯著變化，但給予OA后，Gpx活性反而明顯降低。陽性對照組血清T-AOC值上升，給藥后該趨勢減輕，肝臟內(nèi)T-AOC的變化趨勢同血清結果相反，OA干預

12、后肝臟總抗氧化力水平明顯增高。陽性對照組的血清和肝勻漿GSH含量降低、GSSG含量增加，在OA干預下，GSH顯著增高，GSH/GSSG比值顯著增高，這表明OA能通過恢復GSH系統(tǒng)發(fā)揮保護作用。T-SH結果表明酒OA后能顯著保護酒精對巰基的耗竭作用。血清中MDA含量陽性對照組與陰性對照組相比無顯著改變，OA干預后MDA含量降低。肝勻漿MDA含量陽性對照組明顯增高，OA干預后明顯降低。陽性對照組肝臟Nrf-2、HO-1、GR、SOD-1等抗

13、氧化蛋白表達顯著下調(diào)，肌肉Nrf-2也顯著下調(diào)，OA干預后顯著上調(diào)了上述蛋白的表達，同時還上調(diào)了肝臟Nrf-2的基因表達。組織病理學結果表明，OA給藥都顯著減輕了酒精誘導的胃臟和肝臟組織病理損傷。
　　【結論】
　　成功構建了酒精損傷性QZG細胞模型和動物模型，系統(tǒng)研究了酒精性氧化損傷機制，發(fā)現(xiàn)氧化應激在酒精性氧化損傷的細胞和動物模型中占有突出重要的地位，主要表現(xiàn)為自由基誘導的氧化損傷代謝產(chǎn)物增加，以Nrf2為核心的抗氧化酶

14、鏈表達、活性異常，抗氧化防御系統(tǒng)功能降低；肝臟慢性氧化損傷與脂代謝異常具有密切相關性；利用體外抗氧化劑篩選技術模型，測定了具有保肝作用的單體化學藥物OA的抗氧化反應能力，顯示OA體外直接抗氧化作用相對較弱，可能與其明顯的脂溶解性有關；但是，給酒精性肝損傷細胞和動物模型施加不同劑量的OA，則表現(xiàn)為明顯的抗氧化作用；進一步研究表明，OA具有活化Nrf2為核心的抗氧化酶鏈作用，進而啟動機體整體的抗氧化防御系統(tǒng)功能，有效抑制酒精引起的肝臟氧化應

15、激損傷，可能是保護肝臟防止損傷的重要機制之一。
　　本研究結果提示：OA直接清除自由基的作用較弱，但在酒精誘導的氧化損傷的體外細胞模型和體內(nèi)動物模型中都發(fā)揮了良好的抗氧化保護作用。OA可能通過誘導Nrf-2相關抗氧化酶表達，保護谷胱甘肽氧化還原平衡，提高機體抗氧化酶活性，保護線粒體功能，減輕脂代謝紊亂發(fā)揮其抗氧化作用。本研究結果充分說明OA在酒精性肝損傷相關疾病中具有顯著的研究、開發(fā)、應用前景。本研究為更深一步研究OA在酒精性相關