白藜蘆醇對局灶性腦缺血-再灌注大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、隨著人口老齡化的加劇，腦血管疾病的發(fā)病率明顯上升，而且發(fā)病趨勢有逐漸年輕化的跡象。缺血性神經(jīng)元損傷是威脅人類健康的重要原因之一，但目前仍缺乏切實(shí)有效的防治措施。不同于其他組織細(xì)胞，神經(jīng)元更容易因受到各種有害刺激而死亡。海馬是與空間學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的一個(gè)重要的腦區(qū)，其中 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元對缺氧、缺血特別敏感，受到的損傷也最為嚴(yán)重，而且成年大腦海馬CA1區(qū)的再生能力非常低。因此，如何預(yù)防和保護(hù)缺血性神經(jīng)元損傷一直是腦卒中、腦創(chuàng)傷等疾病

2、的主要治療策略。
　　白藜蘆醇（Resveratrol，Res），非黃酮類多酚化合物，化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基二苯乙烯，在虎杖、葡萄、黎蘆、決明、花生等植物中含量較為豐富。研究表明，Res能抑制N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)突觸的形成及突觸的生長。目前普遍認(rèn)為，缺血性腦損傷時(shí)神經(jīng)元死亡可因 NMDA受體過度激活引起，推測Res有可能是通過調(diào)控腦缺血引起的由NMDA受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，阻斷凋

3、亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，ERK1/2信號通路激活后，能明顯抑制因腦缺血/再灌注損傷的NMDA受體活性，減少Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而對缺血神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。CREB是受ERK1/2調(diào)節(jié)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著十分重要的作用，激活 CREB可促進(jìn)神經(jīng)元的存活，而抑制CREB則促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。大量研究表明，磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)和其主要下

4、游靶目標(biāo)Akt共同構(gòu)成一條重要的 PI3K-Akt抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，很多神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥均能通過激活PI3K-Akt信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　缺血性腦損傷亦有凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、Bax的參與，Bcl-2與 Bax的比值能決定細(xì)胞是否凋亡。雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了Res對缺血性腦損傷具有保護(hù)作用，但有關(guān)Res對缺血再灌注腦損傷預(yù)防和保護(hù)作用的有效時(shí)間窗以及 Res作用的具體分子機(jī)制目前鮮有報(bào)道。
　　本研究分以下

5、兩部分來闡明 Res對缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的調(diào)控作用：（1） NMDA受體介導(dǎo)的ERK1/2-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Res預(yù)處理對大鼠缺血性海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷保護(hù)中的作用；（2）Res慢性給藥對腦缺血再灌注后海馬區(qū)pAkt及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。通過本課題的研究，可以為缺血性腦損傷的藥物治療提供新的靶點(diǎn)，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。
　　1.白藜蘆醇預(yù)處理通過ERK1/2-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻止局灶性

6、腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷
　　在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，（1）90 min MCAO引起大鼠缺血側(cè)腦梗死體積及海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元死亡數(shù)量顯著增加；在缺血前1 h、4 h進(jìn)行Res（30 mg/kg）預(yù)處理明顯縮小了腦梗死體積，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元死亡數(shù)量亦明顯降低；（2）90 min MCAO導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能減退，逃避潛伏期明顯延長；在缺血前1 h、4 h進(jìn)行Res預(yù)處理，均明顯改善了大鼠的空間學(xué)習(xí)記

7、憶功能；（3）探討在腦缺血前30 min側(cè)腦室注射MK-801(NMDA受體阻斷劑)對Res作用的影響。結(jié)果顯示，在MCAO前30 min側(cè)腦室注射MK-801，能明顯減少缺血引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡；對于在缺血前1 h Res預(yù)處理的大鼠，Res給藥前30 min側(cè)腦室注射MK801，阻斷了Res的神經(jīng)保護(hù)作用；而對于在缺血前24 h進(jìn)行Res預(yù)處理的大鼠，Res給藥前30 min側(cè)腦室注射MK801則無效；（4）進(jìn)一步探討對于在

8、缺血前1 h或24 h進(jìn)行Res預(yù)處理的大鼠，在Res給藥前30 min側(cè)腦室注射U0126（ERK1/2抑制劑）對Res作用的影響。結(jié)果顯示，在缺血前30 min側(cè)腦室注射U0126，加重了缺血導(dǎo)致的海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元死亡；對于在缺血前1 h進(jìn)行 Res預(yù)處理的大鼠，側(cè)腦室注射U0126阻斷了Res的神經(jīng)保護(hù)作用，而對于在MCAO前24 h進(jìn)行Res預(yù)處理的大鼠，U0126則無效；（5）在缺血再灌注第5天，與MCAO組相比，在缺血前

9、1 h進(jìn)行Res預(yù)處理使缺血側(cè)海馬CA1區(qū)pERK1/2及pCREB的表達(dá)明顯增加，而在 Res給藥前30 min側(cè)腦室注射 U0126則降低了pERK1/2及pCREB的表達(dá)。提示ERK1/2-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了Res對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2.再灌注后白藜蘆醇慢性給藥通過上調(diào)海馬pAkt及Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax的表達(dá)減輕缺血性腦損傷
　　本研究中繼續(xù)使用90 min MCAO法制備局灶性腦缺血大

10、鼠模型，從缺血再灌注3 h后開始連續(xù)4 d對大鼠腹腔注射Res（30 mg/kg），（1）HE染色結(jié)果顯示，90 min MCAO導(dǎo)致海馬CA1區(qū)大約82%的神經(jīng)元死亡，Res慢性給藥能明顯減少M(fèi)CAO引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡；TUNEL染色結(jié)果顯示，MCAO導(dǎo)致海馬CA1區(qū)大約87%的神經(jīng)元凋亡，Res慢性給藥使海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少；（2）90 min MCAO導(dǎo)致海馬CA1區(qū)LTP誘導(dǎo)障礙，Res慢性給藥可以恢復(fù)L

11、TP的誘導(dǎo)；（3）局灶性腦缺血導(dǎo)致海馬CA3-CA1區(qū)基礎(chǔ)的突觸傳遞功能障礙，但是突觸前的功能沒有受到影響。Res慢性給藥可以改善腦缺血所致的突觸傳遞功能障礙;（4）Western blot結(jié)果顯示Res慢性給藥使Res+MCAO組大鼠海馬區(qū)pAkt表達(dá)明顯升高，但對Res+Sham組大鼠pAkt的表達(dá)沒有明顯影響；（5）與Sham組相比，MCAO組大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值下降；而Res慢性給