白藜蘆醇及早老蛋白1對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬作用的調(diào)控及其機制研究.pdf

1、目的:
　　一、通過觀察中藥單體成分白藜蘆醇對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬作用和炎癥因子分泌的影響，及其對Trem2蛋白表達(dá)及分泌的調(diào)節(jié)作用，探討白藜蘆醇作為抗AD藥物研發(fā)的可能性。
　　二、通過觀察過表達(dá)PS1對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響及其對Trem2轉(zhuǎn)運的調(diào)控，探討以PS1為間接作用靶點調(diào)控Trem2的轉(zhuǎn)運，增強小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ的吞噬，為抗AD中藥的篩選提供更多的思路。
　　方法:
　　一、白藜蘆醇對B

2、V-2細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控及其機制研究
　　1.CCK-8檢測細(xì)胞活力:選取白藜蘆醇5μM、10μM、20μM、40μM為干預(yù)濃度，24小時或48小時后，加入CCK-8試劑，37℃孵育2小時，在酶標(biāo)儀中492nm處讀取96孔板吸光值。
　　2.流式細(xì)胞術(shù):對BV-2細(xì)胞進行不同的干預(yù)之后，加入熒光標(biāo)記的Aβ孵育2小時，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強度來測定BV-2細(xì)胞對于Aβ的吞噬作用。
　　3.分子生物學(xué)實驗:對BV-2細(xì)胞

3、進行不同的干預(yù)之后，采用Western blot檢測BV-2細(xì)胞Trem2總蛋白表達(dá)及上清中sTrem2的分泌量，采用Real-time PCR檢測細(xì)胞IL-1β、TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　二、PS1對BV-2細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控及其機制研究
　　1.分子生物學(xué)實驗:用免疫共沉淀方法檢測PS1與Trem2的蛋白間相互作用，以細(xì)胞膜表面生物素化的方法檢測過表達(dá)PS1對BV-2細(xì)胞內(nèi)Trem2蛋白轉(zhuǎn)運的影響。
　　

4、2.載體病毒感染:采用病毒感染的方法對構(gòu)建BV-2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　3.流式細(xì)胞術(shù):采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PS1過表達(dá)對于BV-2細(xì)胞Aβ吞噬作用的影響。
　　結(jié)果:
　　一、白藜蘆醇對BV-2細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控及其機制研究
　　1在干預(yù)24小時的條件下，5μM、10μM、20μM濃度組白藜蘆醇與各自的空白對照組比較，對于BV-2細(xì)胞活力的影響均無明顯的差異，40μ M濃度組可降低BV-2細(xì)胞的活力。而在干

5、預(yù)48小時的條件下，5μ M、10μM濃度組對于BV-2細(xì)胞的活力仍然沒有影響，20μM、40μM濃度組可降低BV-2細(xì)胞的活力。
　　2.5μM的白藜蘆醇對于BV-2細(xì)胞的吞噬作用略有促進，但相比于對照組，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;10μM、20μM濃度組相對于對照組顯著促進吞噬作用，并且相比于對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.白藜蘆醇10μM劑量組BV-2細(xì)胞的Trem2蛋白表達(dá)量略有升高，但與對照組比較尚不具有統(tǒng)計學(xué)差異;2

6、0μ M劑量組可明顯升高Trem2蛋白表達(dá)量，相對對照組表達(dá)量約為后者的1.7倍，且差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.白藜蘆醇10μM劑量組可一定程度上抑制小膠質(zhì)細(xì)胞sTrem2的分泌，但與對照組比較，差異尚不具有統(tǒng)計學(xué)意義;20μM劑量組可明顯抑制sTrem2的分泌，相對對照組的分泌量為后者的70％左右，且差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.Trem2-Fc4nM、20nM劑量組與相應(yīng)濃度Fc對照組比較，BV-2細(xì)胞對A

7、β的吞噬作用略有降低，但無統(tǒng)計性差異;而40nM劑量組與相應(yīng)濃度對照組比較，BV-2細(xì)胞對Aβ的吞噬作用明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.不同劑量的白藜蘆醇干預(yù)炎癥反應(yīng)模型BV-2細(xì)胞后，白藜蘆醇各個劑量組均可降低細(xì)胞IL-1β的mRNA水平，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。白藜蘆醇對TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄具有一定的下調(diào)作用，但是各劑量組相對對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　二、PS1對BV-2細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控及其機制研

8、究
　　1.Trem2可以共沉淀PS1全長蛋白、PS1-NTF和PS1-CTF，而IgG對照組并沒有檢測到相應(yīng)蛋白條帶。反向的驗證也證明，PS1-NTF抗體與PS1-CTF抗體的免疫沉淀物中，均可檢測到Trem2的表達(dá)，而IgG對照組并沒有出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白條帶。
　　2.BV-2-Vector組與BV-2-PS1組Trem2的蛋白總表達(dá)量基本一致，不存在差異性。細(xì)胞膜Trem2與總Trem2比值的結(jié)果分析表明，BV-2-PS1

9、組比值相對BV-2-Vector組明顯下降，且該差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.BV-2-PS1細(xì)胞系對于FAM-Aβ的吞噬明顯低于BV-2-Vector細(xì)胞系，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。BV-2-PS1-Trem2細(xì)胞系相比BV-2-PS1細(xì)胞系對于FAM-Aβ的吞噬明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　一、白藜蘆醇對BV-2細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控及其機制研究
　　1.白藜蘆醇干預(yù)可以促進BV-2細(xì)胞的吞噬功

10、能，并且該促進作用存在劑量依賴性。
　　2.白藜蘆醇可上調(diào)細(xì)胞Trem2總蛋白的表達(dá)，下調(diào)sTrem2的分泌。
　　3.白藜蘆醇調(diào)節(jié)BV-2細(xì)胞吞噬功能的可能機制為上調(diào)細(xì)胞Trem2的表達(dá)和下調(diào)sTrem2的分泌。
　　4.白藜蘆醇可顯著降低Aβ誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞IL-1β的分泌，對TNF-α的分泌也有一定的下調(diào)作用，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義，需要進一步探討。
　　二、PS1對BV-2細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控及其機制研究