金絲桃苷對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究主要為探究金絲桃苷對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥因子釋放的影響，并探討其潛在作用機(jī)制。
　　方法:
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將BV2細(xì)胞及原代小膠質(zhì)細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后更換成無血清培養(yǎng)基，饑餓處理過夜。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用不同濃度的金絲桃苷預(yù)處理30min，然后用100ng/ml的LPS刺激不同時(shí)間，用ELISA、Griess法、蛋白免疫印跡

2、檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、IL-1β以及TNF-α的釋放量，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平;用蛋白免疫印跡檢測(cè)ERK、JNK、P38及p65/NF-κB信號(hào)通路的變化。
　　結(jié)果:
　　1.金絲桃苷減少由LPS刺激BV2細(xì)胞激活產(chǎn)生的炎癥因子
　　LPS刺激BV2細(xì)胞24h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1β和TNF-α含量明顯增多，而金絲桃苷本身對(duì)這些炎癥因子無明顯作用。經(jīng)金絲桃苷預(yù)處理后的細(xì)胞，

3、LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生的IL-1β和TNF-α呈現(xiàn)劑量依賴性的減少;而且，金絲桃苷能夠一定程度上抑制LPS引起的IL-1β和TNF-α的基因過度表達(dá)。
　　2.金絲桃昔減少LPS刺激BV2細(xì)胞激活產(chǎn)生的NO
　　經(jīng)不同濃度的金絲桃苷預(yù)處理后，LPS刺激BV2產(chǎn)生的NO呈劑量依賴性下降;同時(shí)，金絲桃苷抑制由LPS誘發(fā)的iNOS蛋白的過量表達(dá)也出現(xiàn)劑量依賴性的下降。
　　3.金絲桃苷抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞P38及

4、p65/NF-κB信號(hào)通路的激活
　　我們研究了金絲桃苷對(duì)LPS刺激的BV2細(xì)胞的ERK1/2，JNK1/2，p38和p65/NF-κB激活的影響。結(jié)果顯示:金絲桃苷預(yù)處理細(xì)胞后，可以顯著抑制p38和p65/NF-κB的激活，而不影響ERK1/2，JNK1/2的激活，并且金絲桃苷的預(yù)處理呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性;此外，不同信號(hào)分子被LPS激活的時(shí)間也大體相同，如p-p38、p-p65均在LPS刺激60min后達(dá)到了最高水平。

5、　　4.金絲桃苷通過p38及p65/NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活
　　p38的特異性抑制劑SB203580和p65/NF-κB的特異性抑制劑PDTC分別明顯抑制p38和p65/NF-κB的活化。分別用SB203580和PDTC預(yù)處理細(xì)胞后，SB203580和PDTC均使LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，且SB203580、PDTC分別與金絲桃苷合用還有一定的協(xié)同作用。此外，SB2

6、03580和PDTC使LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO也出現(xiàn)下降并且能夠明顯抑制iNOS蛋白的表達(dá)水平。
　　5.金絲桃苷可以降低小膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)毒性
　　用不同實(shí)驗(yàn)條件處理的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y。用LPS單獨(dú)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞組獲得的條件培養(yǎng)基處理SH-SY5Y細(xì)胞，SH-SY5Y細(xì)胞的存活率出現(xiàn)顯著下降，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而經(jīng)金絲桃苷預(yù)處理后再用LPS刺激的BV2細(xì)胞，所獲得的條件培養(yǎng)基對(duì)SH

7、-SY5Y細(xì)胞與LPS單獨(dú)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞組比較則具有較小的神經(jīng)毒性。
　　6.金絲桃苷抑制LPS誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生的炎癥因子和NO
　　金絲桃苷能夠抑制LPS刺激的原代小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和TNF-α基因的過度表達(dá)。金絲桃苷抑制LPS誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞NO的過量釋放和iNOS蛋白的過度表達(dá)，同時(shí)也呈現(xiàn)出一定程度的劑量依賴性，與BV2細(xì)胞結(jié)果相似。
　　結(jié)論:
　　1.在BV2和原代小膠質(zhì)細(xì)胞中，金絲桃苷