基于小膠質細胞吞噬作用探討“脊髓康”神經保護效應的研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)是一種嚴重致殘性疾病，其引起的殘疾無論對患者、對家庭或對社會都是一種最嚴重的災難，且痛苦和負擔往往伴隨終身。目前基礎及臨床研究認為，SCI后神經元的繼發(fā)性損傷是可能被逆轉的，這為SCI治療提供了可研究方向。
　　小膠質細胞是駐留于中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)內的免疫細胞，其為CNS的免疫與防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠保護CNS免受各種

2、病理因子的侵害，但其有時亦會導致CNS相關病變的進一步惡化。當中風、腦外傷、SCI等神經病變發(fā)生后，小膠質細胞在對損傷局部神經元表現(xiàn)出破壞、修復的雙重作用。一方面，小膠質細胞可做出迅速的免疫應答，定向遷移至病變部位后釋放大量促炎因子啟動炎性反應，過度的、反復的炎癥反應及有害代謝產物對神經系統(tǒng)造成嚴重的損害，導致大量神經元的繼發(fā)性壞死及凋亡，影響神經元的修復、再生;另一方面，小膠質細胞遷移至損傷部位后，其吞噬作用可通過清除凋亡神經元，減少

3、細胞因子、神經毒性物質等釋放，進而抑制過度的免疫炎性反應，協(xié)調、促進神經元網絡狀結構的重建及功能的恢復。故而小膠質細胞在CNS生理病理變化中有著重要意義。
　　“脊髓康”是筆者導師臨床經驗方，臨床實踐及研究證明該方有著良好的臨床療效?；诖朔剑覀兦捌谙到y(tǒng)開展了多項“脊髓康”干預SCI的基礎性研究，結果表明，“脊髓康”對SCI后免疫應答有著重要的調節(jié)作用，其能有效促進損傷神經元的修復再生。目前，中醫(yī)藥對小膠質細胞吞噬作用的研究較少

4、，已有研究主要局限于部分中藥能夠抑制小膠質細胞活化所致的過度免疫炎性反應以降低神經二次損傷的方面，基于此，本研究欲從小膠質細胞吞噬作用角度，探討“脊髓康”有效干預SCI的潛在機制，為SCI的臨床治療提供一定科學依據(jù)。
　　本文第一部分采用慢病毒轉染綠色熒光蛋白基因標記小膠質細胞株BV2，核染色標記死亡神經元的方法，建立了一個可動態(tài)觀察BV2吞噬神經元碎片的體系，研究并證實了“脊髓康”可促進BV2對神經元碎片的吞噬作用;我們認為，中

5、樞神經系統(tǒng)是一個由多種膠質細胞及神經元構成的復雜體系，SCI的發(fā)生必然不是單一系統(tǒng)或某一細胞群的病變，而是多因素的“整體病變”，故在第一部分的研究基礎上，我們提取胎鼠的部分神經組織，未經特殊篩選將其接種于體外環(huán)境中培養(yǎng)，初步、簡易的模擬了一個多因素、立體式、整體性的混雜細胞體系，在誘導混雜細胞體系中神經元凋亡后予“脊髓康”干預，再次證實了“脊髓康”對模擬的“自然混雜體系”中小膠質細胞吞噬功能的促進作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥“整體”干預的理念;上

6、述兩部分實驗表明，“脊髓康”能有效調控小膠質細胞的吞噬功能，那么該作用到底是否與促神經修復有相關性？基于這些問題，我們開展了第三部分實驗，即驗證“脊髓康”是否能通過調控小膠質細胞吞噬作用影響神經元修復再生，在此實驗中，我們成功分離、提純了原代神經元、原代小膠質細胞，建立小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系，“脊髓康”含藥血清間接干預共培養(yǎng)體系，而后以免疫熒光雙重標記法觀察混培養(yǎng)24h后小膠質細胞對神經元碎片的吞噬作用及96h后損傷神經元突起

7、生長情況，我們發(fā)現(xiàn)“脊髓康”促進小膠質細胞清理凋亡神經元碎片的同時，存活神經元的修復再生能力得到了明顯的提升。綜上，我們得出:中藥復方“脊髓康”能夠有效促進小膠質細胞吞噬神經元碎片作用，可能以此改善局部微環(huán)境，促進損傷神經元的修復再生。
　　第一部分“脊髓康”對小膠質細胞吞噬神經元碎片的影響
　　目的:觀察中藥復方“脊髓康”對小膠質細胞吞噬神經元碎片的影響。
　　方法:制備“脊髓康”含藥血清，分離、培養(yǎng)、鑒定原代神經元

8、，慢病毒轉染綠色熒光蛋白基因標記小膠質細胞株BV2，核染色標記神經元，熒光顯微鏡下觀察含藥血清干預后小膠質細胞對神經元碎片的吞噬作用。
　　結果:在吞噬百分率方面，“脊髓康”中、高劑量組均高于空白組(P＜0.05)，與脂多糖組對比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在吞噬指數(shù)方面，“脊髓康”低、中、高劑量組均高于空白組(P＜0.05)，中、高劑量組與脂多糖組對比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:中藥復方“脊髓康”能

9、調控BV2對神經元碎片的吞噬作用，其促進損傷神經元軸突再生的機制可能與此相關。此外，本研究為中醫(yī)藥調控小膠質細胞干預CNS相關疾病的研究提供了新的思路及方法。
　　第二部分“脊髓康”對自然混雜體系中原代小膠質細胞吞噬作用的影響
　　目的:觀察中藥復方“脊髓康”對自然混雜體系中原代小膠質細胞吞噬神經元碎片的影響。
　　方法:制備“脊髓康”含藥血清;分離、培養(yǎng)原代神經細胞，建立混雜細胞體系并予鑒定;以谷氨酸誘導混雜體系中神

10、經元損傷，以“脊髓康”含藥血清干預混雜體系;以一抗β3-tubulin、二抗Alexa594標記神經元骨架及碎片，以一抗CD11b、二抗Alexa488標記小膠質細胞相關膜蛋白，觀察“脊髓康”干預后混雜體系中小膠質細胞對神經元碎片的吞噬作用。
　　結果:在吞噬指數(shù)方面，“脊髓康”含藥血清低、中、高劑量組均高于空白組(P＜0.05)，中、高劑量組較LPS組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在吞噬百分率方面，中、高劑量組均高于空白組(

11、P＜0.05)，中劑量組低于LPS組(P＜0.05)。
　　結論:抗SCI有效方“脊髓康”可調控小膠質細胞清理神經元碎片的作用，改善局部微環(huán)境，促進損傷神經元的修復再生。
　　第三部分“脊髓康”對共培養(yǎng)體系中小膠質細胞吞噬及損傷神經元再生的影響
　　目的:觀察中藥復方“脊髓康”對共培養(yǎng)體系中小膠質細胞吞噬及損傷神經元修復再生的影響。
　　方法:制備“脊髓康”含藥血清，分離、鑒定原代海馬神經元、原代小膠質細胞，谷氨

12、酸誘導神經元損傷，含藥血清預處理小膠質細胞，建立小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系，采用免疫熒光雙重標記法觀察混培養(yǎng)24h后小膠質細胞對神經元碎片的吞噬作用及96h后損傷神經元突起生長情況。
　　結果:混培養(yǎng)24h后，“脊髓康”含藥血清中、高劑量組在吞噬指數(shù)及吞噬百分率方面均高于空白組(P＜0.05)，中劑量組低于LPS組(P＜0.05)，高劑量組則與LPS組無顯著差異(P＞0.05)?；炫囵B(yǎng)96h后，“脊髓康”含藥血清中、高劑量組

13、一級突起數(shù)量多于空白組(P＜0.05)，與LPS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)?！凹顾杩怠敝?、高劑量組平均突起較空白組長(P＜0.05)，與LPS對比，“脊髓康”中劑量組平均神經突起較短(P＜0.05)，而高劑量組則平均突起較長(P＜0.05)。
　　結論:“脊髓康”通過調控小膠質細胞吞噬功能促進損傷神經元的修復與再生，這可能與其促進凋亡物質清理后，于局部微環(huán)境建立一個無形的保護屏障有關，但其詳細機制仍待進一步研究。

14、>　　綜上所述，本研究工作的主要創(chuàng)新之處在于:
　　1、首次從調控小膠質細胞吞噬作用的角度對中醫(yī)藥干預SCI進行了研究，為“脊髓康”溫腎通督抗SCI作用做出了新的科學闡釋。
　　2、自行研究、建立了多種能準確、有效以及動態(tài)觀察小膠質細胞吞噬神經元碎片的方法，驗證了“脊髓康”對小膠質細胞吞噬的調控作用，一定程度上明確了該作用與神經修復再生的相互關系。
　　3、基于中醫(yī)藥干預“整體”理念，及SCI整體病變的思考，體外建立了