TNF-α誘導(dǎo)B16細(xì)胞自體吞噬作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　在前期研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可以誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡，但是其是否能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬目前尚不明確。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞活性、透射電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞內(nèi)是否存在自體吞噬泡及其數(shù)量的變化，分析TNF-α是否能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬；進(jìn)一步檢測自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，分析參與TNF-α誘導(dǎo)的B16細(xì)胞自體吞噬的關(guān)鍵因子；并通過檢測自噬信號(hào)

2、通路上的標(biāo)志性基因和蛋白的表達(dá)，分析TNF-α誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬的信號(hào)通路，以及各通路對(duì)自噬的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，根據(jù)處理方法不同分為對(duì)照組、TNF-α處理組(20ng/ml TNF-α處理12h、24h)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+TNF-α處理組(10mmol/L3-MA預(yù)處理2h，20ng/ml TNF-α處理12h、24h)。
　　2.相差顯微鏡觀察TNF-α處理前

3、后B16細(xì)胞的生長狀態(tài)和細(xì)胞活性。
　　3.TEM觀察TNF-α處理前后B16細(xì)胞內(nèi)自體吞噬泡的變化。
　　4.收取細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因Chop mRNA的表達(dá)變化。
　　5.收取細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡(Westernblot)方法檢測白噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬性死亡

4、標(biāo)志性蛋白Beclin1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路及磷酸肌醇3激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB，又稱Akt)通路關(guān)鍵蛋白核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)及Akt磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，TNF-α處理后的B16細(xì)胞出現(xiàn)明顯的生長抑制現(xiàn)象，可見部分細(xì)胞死亡，TNF-α處理12h后細(xì)胞死亡量約10％，24h后死亡量達(dá)30%，具有明顯的時(shí)效關(guān)系。
　　2.與對(duì)照組相比，TNF-

5、α處理后的B16細(xì)胞內(nèi)，可見許多不同階段的自體吞噬泡。
　　3.與對(duì)照組相比，TNF-α處理12h的B16細(xì)胞中，自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ和自噬性死亡標(biāo)志性蛋白Beclin1的表達(dá)顯著升高，24h較12h降低但仍高于對(duì)照組。3-MA+TNF-α處理組，12h時(shí)LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)水平較TNF-α處理組12h下降，24h較TNF-α處理組24h升高。
　　4.自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12 mRNA在

6、TNF-α處理12h、24h后表達(dá)水平均顯著升高；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因Chop mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，呈時(shí)間依賴性。
　　5.與對(duì)照組相比，TNF-α處理組中p70S6K磷酸化水平顯著下降，呈時(shí)間依賴性；Akt磷酸化水平顯著降低，24h較12h升高。3-MA+TNF-α處理組中，p70S6K磷酸化水平在12h較TNF-α處理組升高，24h較TNF-α處理組降低；Akt磷酸化水平較TNF-α處理24h稍低。
　　結(jié)論：
　

7、　1.TNF-α除了可以誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡，還可以誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬。
　　2.TNF-α誘導(dǎo)B16細(xì)胞的自噬作用達(dá)到一定水平后，白噬體的數(shù)量不再增加，自噬體的降解逐漸增多，從而導(dǎo)致自噬體數(shù)量下降。
　　3.TNF-α可以誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬性死亡。
　　4.TNF-α通過mTOR通路和P13K/Akt通路誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬。
　　5.TNF-α可以導(dǎo)致B16細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)