氨茶堿干預A549細胞吞噬凋亡嗜酸粒細胞的研究.pdf

1、背景： 嗜酸粒細胞浸潤是支氣管哮喘發(fā)病中的重要表現(xiàn)，而嗜酸粒細胞的轉(zhuǎn)歸影響著哮喘病情的轉(zhuǎn)歸。細胞死亡的途徑有兩種：一是死亡，另一是凋亡。其中細胞凋亡因為細胞膜的完整可以使致炎物質(zhì)不外泄。細胞凋亡后因為一系列蛋白在細胞膜上的表達可以被吞噬細胞吞噬。因此凋亡的嗜酸粒細胞被具有吞噬功能的氣道上皮細胞吞噬可以減輕支氣管哮喘中氣道的炎性反應。 氨茶堿是治療支氣管哮喘有效的藥物，近年的實驗及研究表明，氨茶堿除具有舒張支氣管的作用外，

2、還有免疫和抗炎的作用。 已有文獻報道地塞米松可以上調(diào)上皮細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞的能力，并存在濃度依賴效應。對同為治療支氣管哮喘有效的藥物，對于氨茶堿是否可以干預上皮細胞，進而影響其吞噬凋亡的嗜酸粒細胞的能力還不清楚。有文獻報道氨茶堿可以抑制一些炎性因子的分泌，但氨茶堿對上皮細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞的干預作用是否與抑制炎性因子的分泌相關(guān)還未見報道。因此研究氨茶堿對上皮細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞干預的作用及對 IL-6、IL-8分泌

3、的影響，對研究氨茶堿的在治療支氣管哮喘中的作用及研究其抗炎作用的新思路有著重要的意義，并能為支氣管哮喘臨床治療提供新的依據(jù)。 目的： 1、構(gòu)建A549細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞的模型，為進一步研究氨茶堿對上皮細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞干預的作用提供細胞模型。 2、以A549細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞的模型為基礎(chǔ)，研究氨茶堿對A549細胞吞噬能力的干預作用。并了解有無濃度依賴和時間依賴的關(guān)系。 3、研究氨茶堿對由

4、脂多糖及凋亡的嗜酸粒細胞分別刺激后的A549細胞分泌的炎性因子有無抑制作用，是否存在濃度依賴關(guān)系。 4、氨茶堿對上皮細胞吞噬凋亡的嗜酸粒細胞干預的作用與抑制炎性因子的分泌的作用是否相關(guān)。 方法: 通過培養(yǎng)獲得持續(xù)傳代的 A549 細胞，將不同濃度的氨茶堿(0、10<'-3>、10<'-4>、10<'-5>mol/L)在吞噬實驗前24、48、72小時加入到A549細胞中；采用磁細胞分離柱(MACS Column)、

5、CD16磁珠抗體、CD15的磁珠抗體分離純化人外周血嗜酸粒細胞，體外培養(yǎng)48小時后自然老化，通過形態(tài)學和AnnexinV-FITC試劑盒進行嗜酸性粒細胞凋亡鑒定，再加入到已用氨茶堿干預后的A549細胞中，使用鄰聯(lián)茴香胺對吞噬的凋亡嗜酸粒細胞進行過氧化物酶染色，再將A549細胞用蘇木素加以核襯染。運用Olympus倒置顯微鏡及Diagnostic Instruments-Spot insigh數(shù)字圖象采集攝像系統(tǒng)動態(tài)觀察A549細胞吞噬凋

6、亡嗜酸粒細胞現(xiàn)象，并在光鏡下對已固定染色的細胞進行吞噬率統(tǒng)計。另將不同濃度的氨茶堿(0，10<'-3>，10<'-4>，10<'-5>mol/L)分別干預A549細胞、A549與凋亡的嗜酸粒細胞、A549與脂多糖，收獲培養(yǎng)后的上清液，采用放射免疫法檢測白細胞介素IL-6和IL-8的濃度。 結(jié)果 1、A549細胞分別被氨茶堿干預24、48、72小時后，A549細胞吞噬能力隨時間延長明顯下降。 2、A549細胞在氨茶

7、堿以10<'-3>mol/L 濃度干預時的吞噬能力最低，10<'-4>mol/L、10<'-5>mol/L 時的吞噬能力明顯升高。 3、吞噬了凋亡嗜酸粒細胞后A549細胞與未吞噬的A549細胞相比，IL-6、IL-8分泌沒有顯著差異。但較脂多糖刺激 A549 細胞后IL-6、IL-8的分泌值明顯降低。 4、氨茶堿可以抑制脂多糖刺激A549細胞后IL-6、IL-8的分泌且存在濃度依賴關(guān)系。 結(jié)論 1、氨茶堿