小鼠B淋巴細(xì)胞吞噬功能研究.pdf

1、吞噬是鏈接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要免疫機(jī)制，其特征包括吞噬物直徑大于0.5μm、肌動蛋白的聚合和重構(gòu)、以及吞噬溶酶體（phagolysosomes）的形成等。吞噬在固有免疫中直接參與對病原的殺傷，而且吞噬機(jī)制中對抗原成分的分解是進(jìn)一步的抗原處理和呈遞的基礎(chǔ)，因而也參與適應(yīng)性免疫。經(jīng)典免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，吞噬一般由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等專職吞噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等非專職吞噬細(xì)胞執(zhí)行；而B淋巴細(xì)胞作為專職分泌抗體的適應(yīng)性免疫

2、細(xì)胞，不具有吞噬能力。近年來，在早期脊椎動物如硬骨魚、兩棲動物及爬行動物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞具有專職吞噬殺菌能力。而晚期脊椎動物如哺乳動物B細(xì)胞是否具有吞噬能力尚不明確。
　　諸多線索提示B-1細(xì)胞很可能具有專職的吞噬能力。B-1細(xì)胞是一群不同于傳統(tǒng)B-2細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞亞群；在解剖上主要定位于腹膜腔、胸膜腔和腦脊髓膜腔等漿膜腔，表達(dá)既往認(rèn)為只表達(dá)于專職吞噬細(xì)胞的CD11b分子，體外培養(yǎng)時可貼壁生長，外觀上也更接近巨噬細(xì)胞，發(fā)育上

3、與巨噬細(xì)胞等專職吞噬細(xì)胞關(guān)系密切，在演化上也對應(yīng)于硬骨魚等早期脊椎動物的B細(xì)胞；因而很有可能保留有吞噬功能。為進(jìn)一步解釋B細(xì)胞的演化路徑及其在固有免疫及適應(yīng)性免疫中的作用，本課題對小鼠B細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)行了深入研究。主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果：
　　1）B細(xì)胞吞噬現(xiàn)象形態(tài)學(xué)分析：利用C57/BL6小鼠為研究對象，腹腔注射FITC標(biāo)記的60Co滅活金黃葡萄球菌、大腸桿菌及熒光微球，30分鐘后灌洗腹腔（在體吞噬實(shí)驗(yàn)），取腹腔細(xì)胞磁珠分選B細(xì)胞

4、行透射電鏡觀察；以及熒光標(biāo)記CD19等以激光共聚焦顯微鏡觀察以及流式分析。結(jié)果顯示腹腔及脾臟B細(xì)胞吞噬了金葡菌、大腸桿菌及熒光微球。
　　2）肌動蛋白在B細(xì)胞吞噬中的作用分析：取野生型小鼠腹腔B細(xì)胞體外與FITC標(biāo)記的60Co滅活金黃葡萄球菌共孵育（體外吞噬實(shí)驗(yàn)）8小時，以不同劑量秋水仙堿及細(xì)胞松弛素B等肌動蛋白抑制劑干預(yù)，流式檢測吞噬率變化。結(jié)果顯示肌動蛋白抑制劑可以劑量依賴性的抑制B細(xì)胞的吞噬率，提示B細(xì)胞吞噬過程需依賴肌動蛋

5、白重構(gòu)。
　　3）B細(xì)胞吞噬溶酶體形成觀察：以熒光微球行在體吞噬實(shí)驗(yàn)后，取腹腔B細(xì)胞甩片，行酸性磷酸酶染色后以熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示被內(nèi)吞的熒光微球均與溶酶體相結(jié)合或被溶酶體完全包裹，提示吞噬性B細(xì)胞有正常的吞噬溶酶體形成機(jī)制。
　　4）B細(xì)胞殺菌能力分析：取腹腔B細(xì)胞體外與預(yù)先涂板計(jì)數(shù)過活金葡菌共孵育，慶大霉素保護(hù)法檢測胞內(nèi)菌在不同孵育時間后的存活量。發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞內(nèi)吞菌量相對有限，但殺菌效率與其他吞噬細(xì)胞接近。
　　

6、5）吞噬性B細(xì)胞表型特征分析：以金葡菌行B細(xì)胞體外吞噬實(shí)驗(yàn)后熒光標(biāo)記CD19、CD11b、CD5、B220（CD45Ro）等表型后行流式檢測。結(jié)果顯示吞噬性B細(xì)胞以CD11b+B220low的B-1細(xì)胞為主，其中CD5?的B-1b細(xì)胞吞噬能力強(qiáng)于CD5+的B-1a細(xì)胞。
　　6）B細(xì)胞吞噬受體分析：比較野生型鼠與TgVH3B4鼠B細(xì)胞吞噬率；以不同濃度肌動蛋白（TgVH3B4鼠BCR交叉識別抗原之一）干預(yù)抗原競爭阻斷B細(xì)胞體外吞噬

7、實(shí)驗(yàn)，以抗CD11b、TLRs、IgM等的各種抗體干預(yù)野生型小鼠B細(xì)胞體外吞噬，并分析吞噬率不同。結(jié)果顯示阻斷CD11b分子及TLR2等均不能阻斷B細(xì)胞對金葡菌的吞噬，聯(lián)合運(yùn)用抗IgM重鏈及輕鏈抗體可有效阻斷B細(xì)胞對金葡菌的吞噬；TgVH3B4鼠腹腔B細(xì)胞吞噬率高于野生型鼠；且肌動蛋白可競爭抑制TgVH3B4鼠腹腔B細(xì)胞對金葡菌的吞噬；這些均提示BCR充當(dāng)了重要的吞噬受體。
　　7）吞噬性B細(xì)胞遷徙分析：在體吞噬實(shí)驗(yàn)不同時長后收獲

8、腹腔細(xì)胞流式分析B細(xì)胞吞噬率變化，結(jié)合CD11b染色分析表型分布，并取大網(wǎng)膜壓片及脾臟冰凍切片熒光標(biāo)記CD19后熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示腹腔吞噬性B細(xì)胞數(shù)量在1小時之內(nèi)迅速下降；1小時及1天之內(nèi)大網(wǎng)膜和脾臟中可見攜帶金葡菌的B細(xì)胞出現(xiàn)，隨時間延長而增多；CD11b分子可促進(jìn)遷徙；可見吞噬性B細(xì)胞可迅速經(jīng)大網(wǎng)膜向脾臟等次級淋巴器官遷徙。
　　8）T細(xì)胞激活試驗(yàn)：B細(xì)胞體外吞噬滅活金葡菌后與CFSE標(biāo)記的脾臟T細(xì)胞共孵育，5天后熒光標(biāo)

9、記CD4，流式細(xì)胞術(shù)檢測增殖反應(yīng)。結(jié)果顯示吞噬性B細(xì)胞可引起抗原特異性的脾臟CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)，可見吞噬性B細(xì)胞可完成抗原呈遞。
　　主要結(jié)論：
　　本研究首次揭示了哺乳動物B細(xì)胞的吞噬能力，其吞噬具有肌動蛋白依賴性，能夠通過吞噬溶酶體機(jī)制等殺傷內(nèi)吞的細(xì)菌，符合經(jīng)典吞噬機(jī)制的特征；吞噬性B細(xì)胞具有CD11b介導(dǎo)的活躍的遷徙活動，并能夠引起抗原特異性的CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)；BCR參與并促進(jìn)了吞噬。本研究進(jìn)一步提示B-1細(xì)