白藜蘆醇對低氧內(nèi)皮細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　缺氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）是由低氧引起的以持續(xù)肺動脈壓力增高、肺血管結構改建，并伴有右心室肥大為特征的慢性進行性疾病，是肺源性心臟病、高原心臟病等發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。研究表明，肺血管內(nèi)皮損傷及功能紊亂可致肺血管收縮和血管結構重構[1,2]，在HPH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。由于HPH的發(fā)病機制尚不完全清楚，迄今尚缺乏有效的預防及治療措施。以往研究發(fā)現(xiàn)，

2、在 HPH的發(fā)生發(fā)展中炎癥免疫反應發(fā)揮著重要作用。因此，減輕血管內(nèi)皮細胞炎性損傷已經(jīng)成為防治HPH的重要途徑。
　　白藜蘆醇(Resveratrol，RSV）是廣泛存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的一種多酚類化合物，具有廣泛而重要的生物學活性。研究表明，RSV是一種天然抗氧化劑，具有抗炎癥、調節(jié)免疫、抗過敏、抗突變、降低血液黏稠度保持血液暢通、預防癌癥的發(fā)生及發(fā)展等藥理活性，被廣泛應用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領域。有研究

3、發(fā)現(xiàn)，RSV可抑制缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡[3]，其機制與RSV能夠增加心肌組織內(nèi) SIRT1的表達，進而抑制 P53的促凋亡活性，最終抑制缺血再灌注后的心肌細胞凋亡有關[4]。RSV具有抗炎癥反應效應，提示其可拮抗低氧引起的血管內(nèi)皮細胞炎性損傷。但是，關于RSV能否對抗低氧引起的血管內(nèi)皮細胞炎性損傷暫無報道。
　　本課題采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（EA.hy926），1％ O2低氧培養(yǎng)。探討RSV對低氧內(nèi)皮細胞的保護效應及機制，以

4、進一步揭示HPH及其發(fā)病機制，為尋求關鍵有效的HPH防治靶點提供線索和實驗依據(jù)。
　　方法：
　?。?）EA.hy926細胞分為常氧組、低氧12 h組、低氧24 h組、低氧48 h組、低氧72 h組。采用倒置顯微鏡觀察低氧后細胞形態(tài)變化；CCK8法檢測低氧后細胞活力的改變；qRT-PCR法檢測低氧后SIRT1 mRNA表達變化；Western blot法檢測低氧后SIRT1蛋白表達變化。
　?。?）EA.hy926細胞

5、分為常氧組、低氧組、低氧+DMSO、低氧+RSV(0.6μM、1.7μM、5μM、15μM、45μM劑量)組。CCK8法檢測RSV給藥后細胞活力的變化。
　?。?）EA.hy926細胞分為常氧、低氧、低氧+DMSO、低氧+RSV(5μM、15μM、45μM劑量)組。qRT-PCR法檢測SIRT1、IL-6和ICAM-1 mRNA；Western blot法SIRT1、PGC-1α和NF-κB p65蛋白的表達，流式細胞術檢測活性氧

6、(ROS)含量。
　　結果：
　　1.低氧對內(nèi)皮細胞活力及SIRT1表達的影響
　　1.1.低氧對內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響
　　低氧環(huán)境下，EA.hy926細胞由單層鋪路石樣多角形細胞變?yōu)殚L梭形，細胞排列疏松，細胞內(nèi)顆粒狀物質增多；隨著低氧時間的延長，細胞數(shù)量逐漸減少，細胞內(nèi)顆粒狀物質增加明顯，提示低氧對內(nèi)皮細胞造成一定程度的損傷，并且隨著時間延長，損傷作用顯著增強。
　　1.2.低氧對內(nèi)皮細胞活力的影響

7、　　常氧狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)24 h后進入對數(shù)增長期，細胞個數(shù)呈指數(shù)增加。低氧時，細胞增殖速度變慢，培養(yǎng)24 h后，細胞數(shù)量相對常氧減少一倍。培養(yǎng)48 h后，低氧組細胞數(shù)量開始減少，提示低氧環(huán)境可能對內(nèi)皮細胞造成一定程度的損傷，進而導致細胞數(shù)量減少。
　　1.3.低氧對內(nèi)皮細胞SIRT1表達的影響
　　低氧時，內(nèi)皮細胞內(nèi)SIRT1 mRNA和蛋白表達顯著下調,并且隨著培養(yǎng)時間的延長，SIRT1 mRNA和蛋白表達下調趨勢增加

8、，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　2.RSV對低氧內(nèi)皮細胞的保護效應
　　低氧降低EA.hy926細胞活力并且抑制其增殖，不同濃度的RSV（0.6μM、1.7μM、5μM、15μM和45μM）給藥后均可提高細胞活性，抑制細胞凋亡，15μM RSV對細胞的保護作用最明顯。因此，選取5μM、15μM和45μM濃度的RSV作為實驗濃度。
　　與常氧組相比，低氧組IL-6和ICAM-1 mRNA表達顯著增加，差異有統(tǒng)計

9、學意義（p<0.05）；與低氧組相比，不同濃度的RSV（5μM、15μM和45μM）給藥后，IL-6和ICAM-1 mRNA表達均有不同程度的減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　與常氧組相比，低氧組ROS生成顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；與低氧組相比，不同濃度的RSV（5μM、15μM和45μM）給藥后，ROS生成逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　3.RSV保護低氧內(nèi)皮細胞的機制研究<

10、br>　　與常氧組相比，低氧組SIRT1、PGC-1α蛋白表達下調,差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；磷酸化NF-κB p65蛋白表達上調，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；與低氧組相比，RSV作用于細胞后，SIRT1、PGC-1α蛋白表達上調，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；磷酸化NF-κB p65蛋白的表達下調，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　結論：
　　1.低氧抑制內(nèi)皮細胞活性，可能與抑制SIRT1表達，造成