SAP97在光損傷引起的大鼠視網(wǎng)膜水腫中的作用研究.pdf

1、以往的研究發(fā)現(xiàn)膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白家族在突觸的可塑性以及突觸蛋白的聚集方面具有重要作用。而本研究的目的就是為了明確該蛋白家族的成員之一——SAP97是否參與了Muller細(xì)胞對(duì)藍(lán)光所造成的損傷反應(yīng)。
　　第一部分:大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型的建立及視網(wǎng)膜外層水腫的鑒定本實(shí)驗(yàn)選用成年Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重190～210g,正常對(duì)照組12只,光照后ld、2d、3d各時(shí)間點(diǎn)各12只。所有實(shí)驗(yàn)用大鼠均在12h明(20～5

2、0Lux)以及12h暗(0～10LUX)的循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)7d。光照組大鼠予縫線開瞼,1％阿托品擴(kuò)瞳,經(jīng)24h暗適應(yīng)后,放入光照箱中接受24h寬譜藍(lán)光照射,光照波長(zhǎng)為400～440nm。箱內(nèi)齊大鼠眼球水平的光照強(qiáng)度平均為2500Lux,箱內(nèi)溫度控制在22～25℃。光照結(jié)束后置于黑暗中恢復(fù)24h后送回原正常環(huán)境飼養(yǎng)。對(duì)照組大鼠接受48h暗適應(yīng)后送回原正常環(huán)境飼養(yǎng)。
　　在成功建立了大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型后,我們又進(jìn)一步用透射電子顯微鏡

3、觀察了光損傷大鼠的視網(wǎng)膜。結(jié)果顯示:正常SD大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明,視錐視桿細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列整齊規(guī)則,外核層排列緊密,染色均勻,細(xì)胞形態(tài)規(guī)整。而在光照后1天、2天、3天的大鼠視網(wǎng)膜電鏡下均可觀察到凋亡的細(xì)胞核。
　　正常SD大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列整齊疏松,內(nèi)外節(jié)間可見有少量間隙留存,且感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)中線粒體嵴排列規(guī)則。而給予藍(lán)光照射后,視網(wǎng)膜感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)中的線粒體嵴排列紊亂,出現(xiàn)空泡化改變;內(nèi)外節(jié)腫脹,內(nèi)節(jié)間間隙消失,提示存在

4、感光細(xì)胞內(nèi)水腫。
　　另外,正常SD大鼠視網(wǎng)膜色素上皮連接緊密,可以觀察到色素上皮細(xì)胞間的緊密連接。而光損傷后,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間的緊密連接消失,色素上皮細(xì)胞排列彌散,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)融合小體,且其細(xì)胞基底膜的完整性亦受到破壞。
　　本部分的研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜光損傷模型中光感受器的凋亡亦伴有急性視網(wǎng)膜水腫,后者主要表現(xiàn)為感光細(xì)胞的胞內(nèi)水腫及視網(wǎng)膜色素上皮緊密連接的破壞而引起的細(xì)胞外水腫,而這些主要分布在視網(wǎng)膜外層。第二部分:光損傷大

5、鼠視網(wǎng)膜中Mtfller細(xì)胞的反應(yīng)
　　在明確光損傷大鼠視網(wǎng)膜中存在視網(wǎng)膜外層水腫后,我們又進(jìn)一步研究了在這種病理狀態(tài)下Muller細(xì)胞的反應(yīng)。光照后1天、2天、3天,采用免疫熒光染色觀察對(duì)照組和光照組中Mtlller細(xì)胞上AQP4、Kir4.1及SAP97的表達(dá)變化,并分析前二者與后者的關(guān)系;用qRT-PCR和Western_b1ot法對(duì)對(duì)照組和光照組大鼠視網(wǎng)膜中的AQP4、Kir4.1及SAP97的mRNA及蛋白表達(dá)變化進(jìn)行定

6、量分析。
　　結(jié)果顯示:隨著光照后時(shí)間的延長(zhǎng),Kir4.1熒光染色逐漸向視網(wǎng)膜外層延伸。而AQP4和SAP97在正常大鼠視網(wǎng)膜中共分布于視網(wǎng)膜的外叢狀層,而在光照后第3天,兩者共分布于視網(wǎng)膜外核層;對(duì)從對(duì)照組及光損傷大鼠視網(wǎng)膜中新鮮分離出的Muller細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色亦發(fā)現(xiàn)SAP97和AQP4在Muller細(xì)胞的突起上表達(dá)增加;強(qiáng)光照射后第l天SAP97和AQP4mRNA的表達(dá)量均顯著上調(diào),而Kir4.1mRNA的表達(dá)量在光照

7、后第l、2天稍有下降,而在光照后第3天表達(dá)量升高。AQP4和SAP97mRNA的表達(dá)量變化較一致,而Kir4.1mRNA的表達(dá)量的升高較SAP97mRNA延遲;WesteFrn-blot顯示在光照后第2、3天SAP97蛋白的表達(dá)量上升(P(O.05),AQP4蛋白在光照后第3天表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05),而Kir4.1的蛋白表達(dá)量在光照后第l、2、3天較對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　本部分的研究發(fā)現(xiàn),為了應(yīng)對(duì)光損傷引起的視網(wǎng)膜