擬態(tài)弧菌OMPU蛋白的黏附功能及其受體結(jié)合域的確定.pdf

1、I二O一四年五月獨(dú)創(chuàng)性聲明獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完

2、全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)）。學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向

3、：I摘要擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus，Vm)是一種廣宿主病原菌，可感染各種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物引起腹水病，嚴(yán)重威脅我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。細(xì)菌黏附是病原菌引發(fā)感染的關(guān)鍵起始步驟，其實(shí)質(zhì)是細(xì)菌黏附素與宿主受體之間相互作用，使病原菌選擇性地定植于宿主細(xì)胞表面，繼而生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒力因子或侵入深部，損傷組織細(xì)胞，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。從分子水平探明特定病原菌的黏附素及其關(guān)鍵功能域，設(shè)計(jì)和創(chuàng)制基于關(guān)鍵功能域的新型黏附拮抗劑，是目前細(xì)菌性疾病防治的新

4、策略。我們的前期研究結(jié)果表明：擬態(tài)弧菌外膜蛋白U（OmpU）是一種較為保守的抗原蛋白，具有6個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞線性表位，該蛋白N末端含有黏附素基序，抗OmpU抗體可抑制細(xì)菌對(duì)人源上皮細(xì)胞的黏附推測(cè)OmpU可能是擬態(tài)弧菌的黏附素。從前述重要的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象出發(fā)，本研究以鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(EpitheliomaPapulosumCyprinidEPC)作為細(xì)胞黏附模型，建立檢測(cè)細(xì)菌或蛋白黏附特性的技術(shù)平臺(tái)，確證OmpU蛋白的黏附功能，深入解析其受體關(guān)

5、鍵結(jié)合域，從而為創(chuàng)制新型黏附拮抗劑提供理論支持。主要研究?jī)?nèi)容包括：1擬態(tài)弧菌的黏附特性測(cè)定以EPC細(xì)胞作為細(xì)胞黏附模型，建立檢測(cè)細(xì)菌或蛋白黏附的技術(shù)平臺(tái)，研究擬態(tài)弧菌的黏附特性。結(jié)果顯示擬態(tài)弧菌0414菌株可聚集性地黏附于EPC細(xì)胞周?chē)?，其最佳感染?fù)數(shù)（MOI）為60，最佳黏附溫度是28℃，最佳黏附時(shí)間為60min。胰酶、蛋白酶K、半乳糖可完全阻斷0414菌株對(duì)EPC細(xì)胞的黏附，乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和麥芽糖對(duì)細(xì)菌的黏附活性無(wú)影響。

6、結(jié)果表明擬態(tài)弧菌的黏附素為蛋白質(zhì)，與該黏附素相結(jié)合的受體結(jié)構(gòu)中存在寡糖鏈，其中半乳糖殘基決定其特異性。2OmpU基因熒光原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建熒光原核表達(dá)質(zhì)粒pET32aEGFPOmpU，轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，繼而使用NigedResin親合層析柱純化重組發(fā)光蛋白EGFPOmpU。經(jīng)SDSPAGE分析和熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)純化后重組發(fā)光蛋白EGFPOmpU的濃度為1.4mgmL，純度達(dá)到90%