擬態(tài)弧菌ompU多表位基因的設(shè)計、表達及其免疫特性分析.pdf

1、由擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）引起的腹水病是水產(chǎn)動物常見的、危害嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。由于目前尚無商品化的擬態(tài)弧菌疫苗可供水產(chǎn)動物使用，養(yǎng)殖基層控制該病的手段主要是依賴抗菌藥物，但是隨著抗菌藥物的反復(fù)使用，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，抗菌療效不明顯，常導(dǎo)致患病動物大批死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此，開展新型高效的擬態(tài)弧菌疫苗的研究迫在眉睫。本研究選擇擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU為靶標(biāo)，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件篩選OmpU B細(xì)胞表位

2、和優(yōu)化設(shè)計多表位串聯(lián)基因的基礎(chǔ)上，通過基因克隆表達技術(shù)獲得重組多表位蛋白，研究其免疫特性，以篩選出有效的多表位串聯(lián)肽，為研制擬態(tài)弧菌多表位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 首先，應(yīng)用DNAStar軟件，聯(lián)合采用多種不同方法綜合分析擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU的二級結(jié)構(gòu)、柔性區(qū)域、親水性、表面可能性和抗原指數(shù)，篩選其優(yōu)勢B細(xì)胞表位。7個優(yōu)勢B細(xì)胞表位以丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸（AAY）接頭進行不同順序串聯(lián)組合，優(yōu)化設(shè)計2個多表位串聯(lián)基因（ompUe

3、pis和ompU2epis）。委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成多表位串聯(lián)基因ompUepis并構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-OmpUepis。以pUC57-OmpUepis為模板，通過PCR方法獲得pUC57-OmpU2epis（即2拷貝OmpUepis）。
　　 其次，分別將ompUepis和ompU2epis基因亞克隆至融合表達載體pAML-c4x中并進行原核表達。根據(jù)pAML-c4x閱讀框的要求，設(shè)計合成3對特異性引物，以p

4、UC57-OmpUepis為摸板，依次經(jīng)PCR擴增、酶切和連接反應(yīng)獲得ompUepis和ompU2epis基因片段，并定向克隆至表達載體pAML-c4x中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pAML-c4x-OmpUepis和pAML-c4x-OmpU2epis。2個重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coli TB1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，以可溶性形式分別表達了分子量約為52.4kDa和62.5kDa的重組多表位蛋白MBP-OmpUepis與MBP-OmpU2ep

5、is。
　　 最后，采用免疫印跡試驗、間接ELISA試驗和免疫保護性試驗分析重組多表位蛋白的免疫特性。pAML-c4x-OmpUepis/TB1及pAML-c4x-OmpU2epis/TB1重組菌的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以兔抗MBP血清作為一抗，羊抗兔HRP-IgG為二抗進行免疫印跡分析，結(jié)果顯示表達產(chǎn)物能與兔抗MBP血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，表明MBP-OmpUepis及MBP-OmpU2epi

6、s具有免疫反應(yīng)性。分別以重組多表位蛋白MBP-OmpUepis和MBP-OmpU2epis以及標(biāo)簽蛋白MBP免疫BALB/c小鼠，測定免疫小鼠血清中特異性抗體水平及其動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBP-OmpUepis免疫組和MBP-OmpU2epis免疫組小鼠在首次免疫后14d即可檢測出特異性抗體，隨著免疫次數(shù)和免疫時間增加，抗體水平不斷提高，至免疫后第44天抗體水平達到最高峰，隨后逐漸下降。表明重組蛋白MBP-OmpUepis和MBP-O

7、mpU2epis均具有良好的免疫原性。免疫后第44天，用50 LD50擬態(tài)弧菌HX4株菌液（濃度為108 CFU/mL）人工感染各免疫組小鼠，結(jié)果顯示MBP-OmpUepis免疫組和MBP-OmpU2epis免疫組小鼠的免疫保護率分別為90％和20％，MBP免疫組和生理鹽水對照組小鼠全部死亡。表明重組多表位蛋白OmpUepis具有良好的免疫保護性。
　　 綜上所述，重組多表位蛋白OmpUepis具有良好的抗原性和免疫保護性，在擬