弓形蟲多表位基因的疫苗研究及其重組抗原在免疫診斷中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分弓形蟲多表位疫苗研究 1．疫苗的制備構(gòu)建 弓形蟲多表位基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-MAG。以試劑盒大量純化質(zhì)粒pcDNA3-MAG、pcDNA3-SAGl和pcDNA3，用于制備核酸疫苗。以脂質(zhì)體作為免疫佐劑，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。 誘導(dǎo)并純化弓形蟲MAG的原核表達(dá)重組抗原(rMAG1)、SAG1的原核表達(dá)重組抗原(rSAG1)及載體質(zhì)粒pET32a表達(dá)的硫氧還蛋白(Trx)，作為DNA疫苗

2、的加強(qiáng)免疫疫苗。 2．動(dòng)物免疫 以BALB/C小鼠為免疫對(duì)象，按照疫苗的構(gòu)成和免疫方式不同，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為DNA疫苗免疫系列和“基礎(chǔ)一加強(qiáng)”免疫系列，前者均以MAG的DNA疫苗進(jìn)行免疫，后者先以MAG的DNA疫苗免疫，再以重組抗原rMAG進(jìn)行增強(qiáng)免疫。每系列均設(shè)SAGl免疫組、載體對(duì)照組和空白對(duì)照組。 3．免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)性 小鼠免疫前及術(shù)次免疫后第1周、第3周、第5周，分別采集血清，以ELISA試劑盒

3、檢測(cè)各組小鼠的抗弓形蟲IgG抗體、IFN-γ和IL-4含量，術(shù)次免疫后6w，以RH株弓形蟲速殖子感染小鼠(200個(gè)/只)，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的存活時(shí)間和存活率。綜合各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，結(jié)果如下： DNA疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同免疫前、載體對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，MAG的DNA疫苗刺激小鼠產(chǎn)生了特異性抗弓形蟲IgG抗體和高水平IFN-γ，而與SAG1組比較，無(wú)顯著性差異；在對(duì)抗致死劑量弓形蟲的感染上，同SAG1免疫組、載體對(duì)照組和空

4、白對(duì)照組相比，MAG組小鼠不僅延長(zhǎng)了存活期，還有1只存活90天以上(存活率為8.3％)。 DNA疫苗初免、重組抗原疫苗加強(qiáng)免疫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同免疫前、載體對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，MAG組小鼠產(chǎn)生了特異性抗弓形蟲IgG抗體和高水平IFN-γ，與SAGl組比較，IFN-γ含量無(wú)顯著性差異，但I(xiàn)gG抗體水平有顯著差異，MAG組高于SAGl組；在對(duì)抗致死劑量弓形蟲的感染上，同載體對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，MAG組小鼠不僅顯著延長(zhǎng)了存活時(shí)

5、間，還有4只存活90天以上(存活率為33.3％)，同SAG1免疫組相比，小鼠存活時(shí)間無(wú)顯著性差異，但存活率高于SAG1組的16.7％。 就MAG疫苗的兩種不同免疫方式——DNA疫苗單獨(dú)免疫和DNA疫苗初免、重組抗原疫苗加強(qiáng)免疫——進(jìn)行比較，二者激發(fā)的體液、細(xì)胞免疫存在非常顯著性差異，后者顯著高于前者；在對(duì)抗致死劑量弓形蟲的感染上，兩組小鼠的存活時(shí)間具有非常顯著性差異，后者顯著高于前者；兩組均有小鼠存活存活90天以上，前者為1只，

6、存活率為8.3％，后者存活4只，存活率為33.3％。結(jié)果顯示先以DNA疫苗初免、再以重組抗原疫苗加強(qiáng)免疫，較單純DNA免疫，獲得了更好的免疫保護(hù)效果。 實(shí)驗(yàn)中，以弓形蟲強(qiáng)保護(hù)性抗原SAGl(P30)作為多表位疫苗的平行對(duì)照，結(jié)果表明多表位疫苗的免疫效果在整體上優(yōu)于SAG1基因疫苗，盡管后者也獲得了較好的免疫保護(hù)性(如以其基因的DNA疫苗初免、以其重組抗原疫苗加強(qiáng)，使免疫的小鼠獲得了16.7％的存活率)。為了驗(yàn)證弓形蟲多表位疫苗在

7、免疫小鼠后各表位的表達(dá)和呈遞，分別制備了三種重組抗原rSAGl、rGRA2、rROP2，以Western-blot檢測(cè)小鼠免疫血清和上述重組抗原的特異性結(jié)合反應(yīng)。結(jié)果顯示，以兩種方式免疫后的小鼠血清，均可被上述三種重組抗原所特異識(shí)別，表明多表位基因所包含的表位在小鼠體內(nèi)得到了有效的表達(dá)和呈遞，并激發(fā)了特異的體液免疫反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)中，以弓形蟲RH株感染小鼠，空白對(duì)照組小鼠在7天內(nèi)全部死亡。而以MA6的基因疫苗免疫小鼠，小鼠的存活時(shí)

8、間顯著延長(zhǎng)，且有8.3％的小鼠存活90天以上；以DNA疫苗初免、重組抗原疫苗加強(qiáng)免疫小鼠，33.3％的的小鼠存活90天以上。以上結(jié)果表明該疫苗具有良好的免疫保護(hù)性，驗(yàn)證了以多表位的方法制備弓形蟲病疫苗、以復(fù)合免疫的方式增強(qiáng)免疫效果的可行性。 第二部分重組多表位抗原在免疫診斷中的初步應(yīng)用 1．弓形蟲感染小鼠血清的制備及鑒定 以B36株弓形蟲感染小鼠，采集血清，以ELISA和Western-blot檢測(cè)抗弓形蟲IgG

9、抗體，直接鏡檢腦內(nèi)包囊或腹腔速殖子，共獲得17只小鼠的感染血清，效價(jià)最高可達(dá)l：51200。 2．弓形蟲多表位重組抗原的可溶性表達(dá)、純化及鑒定 大量誘導(dǎo)表達(dá)可溶性的弓形蟲多表位重組抗原(rMAG)，以Ni-NTAagarose和割膠電滲對(duì)其進(jìn)行兩步法純化，最后得到了純度達(dá)95.86％的rMAG。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明，弓形蟲多表位重組可溶性抗原不僅能夠被弓形蟲強(qiáng)毒株RH感染的兔血清及抗弓形蟲速殖子主要表面抗原SAGl(P30)

10、的單抗所識(shí)別，而且能被成囊株弓形蟲B36株慢性感染的小鼠血清所識(shí)別，提示該抗原既含有弓形蟲速殖子抗原表位，也含有緩殖子包囊抗原表位。 3．弓形蟲多表位重組抗原在檢測(cè)弓形蟲感染中的應(yīng)用以弓形蟲感染血清為-抗，篩選重組弓形蟲多表位抗原的最佳包被濃度為3μg/ml，用于制備ELISA檢測(cè)試劑盒。 檢測(cè)小鼠血清141份，其中陽(yáng)性小鼠感染血清為117份、正常小鼠血清24份，結(jié)果顯示，該試劑盒敏感性為88.88％(104/117×100％)

11、，特異性為91.67％(22/24×100％)，一致性為89.36％((104+22)/141×100％)。 檢測(cè)兔血清24份，其中急性感染弓形蟲的兔血清18份，正常兔血清6份，陽(yáng)性血清檢出率為94.4％，總一致性為91.5％((17+5)/24×100％)。 以上結(jié)果顯示，弓形蟲多表位抗原試劑盒既可以檢測(cè)弓形蟲急性感染血清，又可以檢測(cè)弓形蟲慢性感染血清，初步證實(shí)了多表位抗原用于弓形蟲感染診斷中的優(yōu)勢(shì)，為試劑盒的下一步應(yīng)