感染牙鲆的豚鏈球菌的類(lèi)M蛋白及其抗原性分析.pdf

1、鏈球菌是引起魚(yú)類(lèi)疾病的重要病原菌之一，許多養(yǎng)殖和野生品種的魚(yú)類(lèi)都對(duì)鏈球菌敏感，包括牙鲆、大菱鲆、銀鮭、羅非魚(yú)、虹鱒和美國(guó)紅魚(yú)等三十多種。本論文研究了感染牙鲆的豚鏈球菌的致病性和類(lèi)M蛋白等方面的工作。對(duì)從患病牙鲆上分離的3株鏈球菌進(jìn)行了人工感染實(shí)驗(yàn)，生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定為豚鏈球菌(Streptococcus iniae)。用該菌免疫兔和大鼠制備抗血清，間接免疫熒光抗體方法檢測(cè)抗血清的特異性。用熱酸法、熱堿法和胃蛋白酶消化法提取豚鏈球菌NUF8

2、49的類(lèi)M蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法分析比較各方法的差異性。而后采用熱酸法提取主要兩種鏈球菌的類(lèi)M蛋白，分析主要類(lèi)M蛋白的結(jié)構(gòu)組成及其抗原性。將熱酸抽提的類(lèi)M蛋白、弱毒菌株NUF693分別免疫牙鲆，通過(guò)對(duì)牙鲆的保護(hù)率初步探討鏈球菌的類(lèi)M蛋白的抗原性和免疫保護(hù)力。具體方法和結(jié)果如下： 本研究對(duì)從患病牙鲆上分離的3株鏈球菌進(jìn)行了人工感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，NUF849為較強(qiáng)毒力的菌株，半致死量LD50為3.7×

3、105CFU/尾，NUF693和NUF701半致死量LD50分別為1.4×107CFU/尾和4.6×107CFU/尾，為毒力較弱的菌株。三株細(xì)菌采用常規(guī)生理生化及API系統(tǒng)鑒定，最終判定3株細(xì)菌均為豚鏈球菌(Streptococcus iniae)。 用菌株NUF849的全菌免疫新西蘭白兔和健康大鼠，發(fā)現(xiàn)其能有效刺激新西蘭白兔和大鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，獲得抗血清。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)得血清抗體效價(jià)分別為1600和800。

4、免疫熒光抗體技術(shù)(IFAT)檢測(cè)表明鼠抗血清與NUF849發(fā)生特異性結(jié)合，與停乳鏈球菌發(fā)生部分交叉反應(yīng)，與弧菌屬的部分細(xì)菌沒(méi)有交叉。 分別用熱酸抽提法、堿抽提法和胃蛋白酶消化法分離豚鏈球菌NUF849的類(lèi)M蛋白，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot印跡法分析比較三種方法所提類(lèi)M蛋白的組成和抗原性差異。結(jié)果表明，不同方法提取的類(lèi)M蛋白結(jié)構(gòu)組成和抗原性均不同。熱酸抽提法分離制備的類(lèi)M蛋白得率和純度都較其它兩種方法高，蛋白的

5、抗原性保持較好。采用熱酸提取法提取5株豚鏈球菌NUF633、NUF693、NUF701、NUF812、NUF849和2株停乳鏈球菌SD、L2的類(lèi)M蛋白，其SDS-PAGE圖譜明顯不同，種間差異明顯。Western-blot結(jié)果顯示，兔抗豚鏈球菌血清可與豚鏈球菌的兩條類(lèi)M蛋白帶結(jié)合，分子量分別為60和37kDa；與停乳鏈球菌的兩條類(lèi)M蛋白帶結(jié)合，分子量為68和37kDa。兩種鏈球菌主要類(lèi)M蛋白組成及其抗原性差異明顯。分子量37kDa的類(lèi)M