三種梨潛隱病毒TR-PCR和RT-LAMP檢測技術(shù)研究.pdf

1、蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Applecholortoticleafspotvirus，ACLSV)和蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus，ASGV)是栽培梨和蘋果上最常見的病毒，經(jīng)常復(fù)合侵染，梨樹一旦帶毒，終身受害，給梨樹生產(chǎn)帶來重大的損失。培育無病毒的梨樹苗木，進行無病毒栽培是防治關(guān)鍵，而做好田間樣品、脫毒苗木以及梨砧木樣品的病毒檢測工作，加強梨樹主要

2、病毒的檢測，建立高效、靈敏的檢測手段十分必要。本研究建立了多重PCR可以同時檢測三種病毒適用于大批量樣品檢測，巢式PCR及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法檢測靈敏度非常的高，主要工作如下:
　　1、本研究根據(jù)GenBank中登陸的ASPV和ACLSV的基因組序列，設(shè)計篩選出特異性檢測ASPV和ACLSV的引物。確定了可同時檢測梨ASGV、ACLSV和ASPV的多重RT-PCR引物組合:ASGVU/2-ACLSVA52/A53-ASPV247F/

3、R，目標(biāo)片段分別為500bp、358bp和247bp。同時對多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如引物和模板用量、退火溫度等進行優(yōu)化。靈敏度測定表明，多重RT-PCR方法檢測靈敏度與常規(guī)單一RT-PCR基本一致。檢測效果評價結(jié)果表明，多重RT-PCR方法能夠同時適用于梨和蘋果休眠枝條以及葉片等不同植物部位的三種潛隱病毒的擴增。通過對田間隨機采集的36份梨樣品的檢測結(jié)果統(tǒng)計，該方法與單一RT-PCR檢測一致率高達(dá)97.2％以上。目前該方法已應(yīng)用于

4、大量田間梨和蘋果樣品的高通量檢測工作。
　　2、在已建立的多重RT-PCR基礎(chǔ)上加入巢式PCR技術(shù)，建立了三種潛隱病毒的巢式-多重RT-PCR擴增方法。分別設(shè)計三種梨潛隱病毒的上游檢測引物，和位于Poly(A)的M4一起作為巢式外側(cè)引物，巢式內(nèi)側(cè)引物是已建立的多重RT-PCR引物。兩套引物對模板進行兩次擴增，提高了特異性，確保檢測的準(zhǔn)確性。巢式-多重RT-PCR可以很大程度上提高檢測效率，其靈敏度是多重RT-PCR的105倍。目前

5、該方法已應(yīng)用于脫毒苗木以及砧木的檢測工作，取得了良好的效果。
　　3、利用PrimerExplorerV4軟件設(shè)計篩選了4條LAMP引物，并對LAMP反應(yīng)體系中的dNTP濃度、Mg2+濃度以及反應(yīng)溫度梯度進行優(yōu)化，確定最適反應(yīng)條件。最終建立了能夠特異性的擴增ASGV的LAMP擴增體系，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察其片段大小與理論值相符合，建立的LAMP方法檢測ASGV特異性高。該方法檢測靈敏度是普